تساعد هذه الطريقة على مراقبة الميتوفاجي في الخلايا الحية باستخدام صبغة الميتوكوندريا الخضراء الفلورية وصبغة الليزوزوم الفلورية الحمراء. يلعب الميتوفاجي دورا مهما في الحفاظ على توازن الميتوكوندريا والجوانب المختلفة للوظيفة الخلوية. يمكن أن توفر هذه التقنية نهجا جديدا لعلاج الأمراض المرتبطة بالميتوكوندريا.
هذا الإجراء ليس معقدا للغاية. يعد التقاط صور واضحة أمرا مهما للغاية لحساب تراكب الميتوكوندريا والليزوزومات. للبدء ، استزرع الخلايا الليفية الجنينية للفأر أو خلايا MEF في طبق زراعة الخلايا 10 سم مع 10 ملليلتر من وسط النسر المعدل من Dulbecco أو DMEM.
احتضان عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون ومراقبة الخلايا تحت المجهر بتكبير 100X. عندما تصل الخلايا إلى 80 إلى 90٪ من التقاء، اغسلها بملليلتر من محلول ملحي مخزن بالفوسفات من دولبيكو. ثم أضف ملليلتر من 0.05٪ تربسين EDTA لمدة دقيقة واحدة لفصل الخلايا ، متبوعا بملليلتر من DMEM لإيقاف التفاعل.
الطرد المركزي تعليق الخلية في 100 غرام لمدة ثلاث دقائق وإعادة تعليق بيليه في واحد ملليلتر DMEM. عد الخلايا باستخدام عداد الخلايا الآلي وشرائح غرفة عد الخلايا وقم بتلقيح 1.5 في 10 إلى الخلايا السادسة في طبق زراعة خلايا جديد يبلغ طوله 10 سنتيمترات يحتوي على 10 ملليلتر من DMEM. بالنسبة لمقايسة الميتوفاجي ، قم بإعداد معلق خلوي كما هو موصوف وقم بتخفيف تعليق الخلية إلى واحد في 10 إلى الخلايا الخامسة لكل ملليلتر من DMEM الطازج.
أضف ملليلتر من معلق الخلية المخفف إلى طبق متحد البؤر 20 ملم وهز الطبق في صليب. احتضان عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 24 ساعة. إعداد حلول العمل من الأصباغ عن طريق تخفيف حلول المخزون.
أضف اثنين ميكرولتر لكل من صبغة الميتوكوندريا 0.2 مليمولار وصبغة الليزوزوم الدقيقة 50 إلى ملليلتر من DMEM للحصول على تركيز عمل قدره 0.2 صبغة ميتوكوندريا ميكرومولية وصبغة ليزوزوم نانومولية 50. أخرج الوسط من طبق الثقافة متحد البؤر وأضف ملليلتر واحد من محلول التلوين لتغطية الخلايا. ضع طبق زراعة الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 20 إلى 30 دقيقة.
اضبط معلمات برنامج التصوير المجهري متحد البؤر. بالنسبة لصور الإثارة المزدوجة ، استخدم الإثارة المتسلسلة عند 488 نانومتر و 543 نانومتر واجمع الانبعاثات عند 505 إلى 545 نانومتر وأكبر من 560 نانومتر على التوالي. قم بإزالة الطبق المتوسط الذي يحتوي على الصبغة من الحاضنة وأضف ملليلتر واحد من Krebs-Henseleit أو KH buffer إلى الطبق.
للحث على الميتوفاجي ، عالج الخلايا باستخدام FCCP في ميكرومولار واحد في محلول KH لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة وانتقل على الفور إلى تصوير الخلايا باستخدام المجهر متحد البؤر. ضع كمية مناسبة من الزيت على الجزء العلوي من عدسة الزيت 63X. ضع العينة على مرحلة العينة من المجهر متحد البؤر وحركها مباشرة فوق العدسة الشيئية.
استخدم برنامج التصوير للعثور على العينة بالنقر فوق علامة التبويب تحديد الموقع في الزاوية العلوية اليسرى من واجهة البرنامج. اختر مجموعة فلاتر خضراء للتجربة. استخدم مقبض الضبط الخشن للتركيز البؤري بسرعة عن طريق تحريك العدسة الشيئية لأعلى ولأسفل.
بعد أن تكون عينة الخلية مرئية بوضوح من خلال العدسة ، ابحث عن منطقة الخلايا المفردة وقم بتركيزها وانقلها إلى مركز مجال الرؤية. انقر فوق علامة التبويب الاستحواذ في الزاوية العلوية اليسرى من واجهة البرنامج للحصول على الصور. حدد فقط قناة 488 نانومتر ودقة الإطار 1024 × 1024 للمعاينة.
انقر فوق علامة التبويب Live في الزاوية اليسرى العليا لبدء الفحص المباشر. اضبط مجال الرؤية إلى أكثر حدة واضبط طاقة الليزر عن طريق تحريك شريط التمرير إلى اليسار أو اليمين. حافظ على إعداد الكسب أقل من 600 لتجنب التعرض الزائد.
اضبط قيمة الثقب على 156 ، واكتسب القيمة إلى 545 وقيمة الإزاحة الرقمية إلى الصفر. حدد أفضل مجال رؤية ، وتحقق من القناتين واختر دقة الإطار 1024 × 1024. انقر فوق Snap للحصول على صور 2D وحفظ الصور التي تم الحصول عليها.
في هذه الدراسة ، تم استخدام FFCP لتحفيز الميتوفاجي في خلايا MEF للتصوير متحد البؤر. تظهر هنا صور تمثيلية لخلايا ملطخة بصبغة الميتوكوندريا الخضراء الفلورية التي تظهر الميتوكوندريا وملطخة بصبغة الليزوزوم الأحمر الفلورية التي تظهر الليزوزوم. عندما تجتاح الميتوكوندريا التالفة ذات اللون الأخضر الليزوزومات الملطخة باللون الأحمر ، يتداخل التألق الأخضر والأحمر للكشف عن الليزوزومات الصفراء الموضعية المشتركة.
تتوافق النقاط الصفراء مع هذه الجسيمات الحالة الميتوكوندريا الموضعية التي تمثل الميتوفاجي المستمر ، وبالتالي يمكن حسابها لتقييم مدى الميتوفاجي. يعد تحضير محلول عملي من الأصباغ لتلطيخ الميتوكوندريا والليزوزوم والحفاظ على التقاء الخلايا المناسب عند التصوير باستخدام الفحص المجهري متحد البؤر من الخطوات الرئيسية التي يجب تذكرها. يمكن أيضا استخدام هذا الإجراء لتحليل عدد الميتوكوندريا والتشكل وهو أمر مهم لتقييم ديناميكيات الميتوكوندريا.
يرتبط Mitophagy ارتباطا وثيقا بمجموعة متنوعة من الأمراض البشرية ويمكن استخدام هذه التقنية لاستكشاف العلاقة بين الميتوفاجي والأمراض البشرية.
