שיטה זו מסייעת לצפות במיטופגיה בתאים חיים באמצעות צבע מיטוכונדריה ירוק-פלואורסצנטי וצבע ליזוזום אדום-פלואורסצנטי. מיטופגיה ממלאת תפקיד חשוב בשמירה על הומאוסטזיס של המיטוכונדריה ועל היבטים שונים של תפקוד התא. טכניקה זו עשויה לספק גישה חדשה לטיפול במחלות הקשורות למיטוכונדריה.
הליך זה אינו מסובך מאוד. לכידת תמונות ברורות חשובה מאוד לספירת שכבת העל של המיטוכונדריה והליזוזומים. כדי להתחיל, עכבר תרבית פיברובלסט עוברי או תאי MEF בצלחת תרבית תאים בגודל 10 ס"מ עם 10 מיליליטר של מדיום הנשר המתוקן של דולבקו או DMEM.
לדגום ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו-חמצני ולנטר את התאים תחת מיקרוסקופ בהגדלה של פי 100. כאשר התאים מגיעים למפגש של 80 עד 90%, שטפו אותם עם שני מיליליטרים של מלח זרחן של דולבקו. לאחר מכן להוסיף שני מיליליטר של 0.05% טריפסין EDTA במשך דקה אחת כדי לנתק את התאים, ואחריו שני מיליליטר של DMEM כדי לעצור את התגובה.
צנטריפוגה של מתלה התא ב 100 G במשך שלוש דקות ולהניח את הכדור במיליליטר אחד DMEM. לספור את התאים באמצעות מונה תאים אוטומטי ותא ספירת תאים שקופיות ולחסן 1.5 כפול 10 עד התאים השישי לתוך צלחת תרבית תאים חדשה של 10 ס"מ המכילה 10 מיליליטר של DMEM. עבור בדיקת המיטופגיה, הכינו תרחיף תאים כמתואר ודללו את תרחיף התאים לפעם אחת 10 לתאים החמישים למיליליטר של DMEM טרי.
מוסיפים שני מיליליטר של תרחיף התאים המדולל לצלחת קונפוקלית של 20 מילימטר ומנערים את התבשיל בצלב. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני במשך 24 שעות. הכן פתרונות עבודה של הצבעים על ידי דילול פתרונות המלאי.
הוסף שני מיקרוליטרים כל אחד של צבע מיטוכונדריאלי 0.2 מילימולרי ו-50 צבע ליזוזום מיקרומולרי לשני מיליליטר של DMEM כדי להשיג ריכוז עבודה של 0.2 צבע מיטוכונדריאלי מיקרומולרי ו-50 צבע ליזוזום ננומולרי. מוציאים את המדיום מצלחת התרבית הקונפוקלית ומוסיפים מיליליטר אחד מתמיסת ההכתמה כדי לכסות את התאים. הניחו את צלחת תרבית התאים על 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו-חמצני למשך 20 עד 30 דקות.
הגדר את הפרמטרים של תוכנת הדמיית המיקרוסקופיה הקונפוקלית. עבור תמונות עירור כפולות, השתמש בעירור רציף ב- 488 ננומטר ו- 543 ננומטר ואסוף פליטה ב- 505 עד 545 ננומטר ויותר מ- 560 ננומטר בהתאמה. מוציאים את צלחת התרבית הבינונית המכילה את הצבע מהאינקובטור ומוסיפים מיליליטר אחד של קרבס-הנסלייט או חיץ KH לתבשיל.
כדי לגרום למיטופגיה, טפלו בתאים עם FCCP במיקרומולר אחד במאגר KH במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר ומיד המשיכו לדמות את התאים באמצעות המיקרוסקופ הקונפוקלי. יש למרוח כמות מתאימה של שמן על החלק העליון של עדשת השמן 63X. מניחים את הדגימה על שלב הדגימה של המיקרוסקופ הקונפוקלי ומזיזים אותה ישירות מעל העדשה האובייקטיבית.
השתמש בתוכנת ההדמיה כדי למצוא את הדוגמה על ידי לחיצה על איתור הכרטיסייה בפינה השמאלית העליונה של ממשק התוכנה. בחרו ערכת מסננים ירוקה לניסוי. השתמש בידית הכוונון הגסה כדי להתמקד במהירות על-ידי הזזת העדשה האובייקטיבית למעלה ולמטה.
לאחר שדגימת התא נראית בבירור דרך העינית, חפש ומקד את האזור של תאים בודדים והזז אותו למרכז שדה הראייה. לחץ על רכישה הכרטיסייה בפינה השמאלית העליונה של ממשק התוכנה כדי לרכוש תמונות. בחר רק את תעלת הננומטר של 488 ואת רזולוציית המסגרת 1024 על 1024 לתצוגה מקדימה.
לחץ על הכרטיסייה Live בפינה הימנית העליונה כדי להתחיל סריקה בשידור חי. התאם את שדה הראייה לחד ביותר וכוונן את עוצמת הלייזר על-ידי הזזת המחוון שמאלה או ימינה. שמור על הגדרת הרווח מתחת ל-600 כדי להימנע מחשיפת יתר.
התאם את ערך חור הסיכה ל- 156, ערך הרווח ל- 545 וערך ההסטה הדיגיטלית לאפס. בחר את שדה הראייה הטוב ביותר, בדוק את שני הערוצים ובחר את רזולוציית המסגרת 1024 על 1024. לחצו על 'הצמד' כדי לקבל תמונות דו-ממדיות ולשמור את התמונות שנרכשו.
במחקר זה, FFCP שימש להפעלת מיטופגיה בתאי MEF לצורך הדמיה קונפוקלית. תמונות מייצגות של תאים המוכתמים בצבע המיטוכונדריה הירוק-פלואורסצנטי המציג מיטוכונדריה ומוכתמים בצבע ליזוזום אדום-פלואורסצנטי המציג ליזוזום מוצגות כאן. כאשר מיטוכונדריה מוכתמת בירוק נבלעים בליזוזומים המוכתמים באדום, הפלואורסצנטיות הירוקה והאדומה חופפות וחושפות ליזוזומים מיטוכונדריה צהובים.
הנקודות הצהובות מתאימות לליזוזומים מיטוכונדריה מקומיים אלה המייצגים מיטופגיה מתמשכת, ולכן ניתן לספור אותן כדי להעריך את היקף המיטופגיה. הכנת תמיסה עובדת של צבעים למיטוכונדריה ולהכתמת ליזוזום ושמירה על מפגש תאים מתאים בעת הדמיה עם מיקרוסקופיה קונפוקלית הם שלבים מרכזיים שיש לזכור. הליך זה יכול לשמש גם לניתוח מספר המיטוכונדריה והמורפולוגיה החשובה להערכת הדינמיקה המיטוכונדריאלית.
מיטופגיה קשורה קשר הדוק למגוון מחלות אנושיות וניתן להשתמש בטכניקה זו כדי לחקור את הקשר בין מיטופגיה למחלות אנושיות.
