이 방법은 세포 투과성 녹색 형광 미토콘드리아 염료와 적색 형광 리소좀 염료를 사용하여 살아있는 세포에서 미토파지를 관찰하는 데 도움이 됩니다. Mitophagy는 미토콘드리아 항상성과 세포 기능의 다양한 측면을 유지하는 데 중요한 역할을합니다. 이 기술은 미토콘드리아 관련 질병의 치료에 대한 새로운 접근법을 제공 할 수 있습니다.
이 절차는 그리 복잡하지 않습니다. 선명한 이미지를 캡처하는 것은 미토콘드리아와 리소좀의 오버레이를 계산하는 데 매우 중요합니다. 시작하려면 마우스 배아 섬유아세포 또는 MEF 세포를 Dulbecco의 변형 독수리 배지 또는 DMEM 10밀리리터와 함께 10cm 세포 배양 접시에서 배양합니다.
섭씨 37도 및 5 % 이산화탄소에서 배양하고 100X 배율로 현미경으로 세포를 모니터링합니다. 세포가 80-90 % 컨플루언시에 도달하면 Dulbecco의 인산염 완충 식염수 2 밀리리터로 씻어냅니다. 그런 다음 0.05 % 트립신 EDTA 2 밀리리터를 1 분 동안 첨가하여 세포를 해리시킨 다음 DMEM 2 밀리리터를 첨가하여 반응을 중지시킵니다.
세포 현탁액을 100G에서 3분 동안 원심분리하고 펠릿을 1밀리리터 DMEM에 재현탁합니다. 자동 세포 계수기 및 세포 계수 챔버 슬라이드를 사용하여 세포를 계수하고 10 밀리리터의 DMEM이 포함된 새로운 10cm 세포 배양 접시에 6번째 세포에 1.5배 10배를 접종합니다. 미토파지 분석을 위해, 기재된 바와 같이 세포 현탁액을 제조하고, 세포 현탁액을 신선한 DMEM의 밀리리터당 10 내지 5번째 세포로 희석한다.
희석 된 세포 현탁액 2 밀리리터를 20 밀리미터 공초점 접시에 넣고 접시를 십자가로 흔든다. 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 24시간 동안 배양합니다. 저장 용액을 희석하여 염료의 작업 용액을 준비하십시오.
2 밀리리터의 DMEM에 0.2 밀리몰 미토콘드리아 염료 및 50 마이크로 몰 리소좀 염료의 각각 2 마이크로 리터를 첨가하여 0.2 마이크로 몰 미토콘드리아 염료 및 50 나노 몰 리소좀 염료의 작동 농도를 얻는다. 컨포칼 배양 접시에서 배지를 제거하고 염색 용액 1밀리리터를 추가하여 세포를 덮습니다. 세포 배양 접시를 섭씨 37도 및 5% 이산화탄소에 20-30분 동안 두십시오.
컨포칼 현미경 이미징 소프트웨어의 파라미터를 설정합니다. 이중 여기 이미지의 경우 488나노미터 및 543나노미터에서 순차 여기를 사용하고 각각 505 - 545나노미터 및 560나노미터 이상에서 방출을 수집합니다. 인큐베이터에서 염료가 들어있는 배양 배지 접시를 제거하고 1 밀리리터의 Krebs-Henseleit 또는 KH 버퍼를 접시에 첨가하십시오.
미토파지를 유도하기 위해, 실온에서 10분 동안 KH 완충액 중 1개의 마이크로몰에서 FCCP로 세포를 처리하고 즉시 컨포칼 현미경을 사용하여 세포를 이미지화하기 진행한다. 63X 오일 렌즈 상단에 적당량의 오일을 바릅니다. 샘플을 컨포칼 현미경의 샘플 스테이지에 놓고 대물 렌즈 바로 위로 이동합니다.
이미징 소프트웨어를 사용하여 소프트웨어 인터페이스의 왼쪽 상단 모서리에 있는 찾기 탭을 클릭하여 샘플을 찾습니다. 실험에 사용할 녹색 필터 집합을 선택합니다. 거친 조정 손잡이를 사용하여 대물 렌즈를 위아래로 움직여 빠르게 초점을 맞춥니다.
접안 렌즈를 통해 세포 샘플을 명확하게 볼 수있게되면 단일 세포 영역을 검색하고 초점을 맞추고 시야의 중심으로 이동합니다. 소프트웨어 인터페이스의 왼쪽 상단 모서리에 있는 획득 탭을 클릭하여 이미지를 획득합니다. 미리 보려면 488나노미터 채널과 프레임 해상도 1024 x 1024만 선택합니다.
왼쪽 상단 모서리에 있는 라이브 탭을 클릭하여 라이브 스캔을 시작합니다. 시야를 가장 선명하게 조정하고 슬라이더를 왼쪽 또는 오른쪽으로 움직여 레이저 출력을 조정합니다. 과다 노출을 방지하기 위해 게인 설정을 600 미만으로 유지하십시오.
핀홀 값을 156으로, 게인 값을 545로, 디지털 오프셋 값을 0으로 조정합니다. 최상의 시야를 선택하고 두 채널을 확인한 다음 프레임 해상도 1024 x 1024를 선택합니다. 스냅(Snap)을 클릭하여 2D 이미지를 획득하고 획득한 이미지를 저장합니다.
이 연구에서 FFCP는 컨포칼 이미징을 위해 MEF 세포에서 미토파지를 촉발하는 데 사용되었습니다. 미토콘드리아를 나타내는 녹색 형광 미토콘드리아 염료로 염색하고 리소좀을 나타내는 적색 형광 리소좀 염료로 염색한 세포의 대표 이미지가 여기에 나와 있습니다. 손상된 녹색으로 염색된 미토콘드리아가 붉게 염색된 리소좀에 휩싸이면 녹색과 빨간색 형광이 겹쳐져 노란색의 공동 국소화된 미토콘드리아 리소좀이 드러납니다.
노란색 점은 진행중인 미토파지를 나타내는 이러한 공동 국소화 된 미토콘드리아 리소좀에 해당하므로 미토파지의 범위를 평가하기 위해 계산할 수 있습니다. 미토콘드리아 및 리소좀 염색을 위한 염료 작업 용액의 준비와 컨포칼 현미경으로 이미징할 때 적절한 세포 밀도를 유지하는 것이 기억해야 할 핵심 단계입니다. 이 절차는 또한 미토콘드리아 역학을 평가하는 데 중요한 미토콘드리아 수와 형태를 분석하는 데 사용할 수 있습니다.
Mitophagy는 다양한 인간 질병과 밀접한 관련이 있으며이 기술은 Mitophagy와 인간 질병 사이의 연관성을 탐구하는 데 사용될 수 있습니다.
