この方法は、細胞透過性緑色蛍光ミトコンドリア色素と赤色蛍光リソソーム色素を用いて、生細胞のマイトファジーを観察するのに役立ちます。マイトファジーは、ミトコンドリアの恒常性や細胞機能のさまざまな側面を維持する上で重要な役割を果たしています。この技術は、ミトコンドリア関連疾患の治療への新しいアプローチを提供する可能性があります。
この手順はそれほど複雑ではありません。鮮明な画像をキャプチャすることは、ミトコンドリアとリソソームのオーバーレイをカウントするために非常に重要です。まず、マウス胚性線維芽細胞またはMEF細胞を、10ミリリットルのダルベッコ改変イーグル培地またはDMEMを含む10センチメートルの細胞培養皿で培養します。
摂氏37度、二酸化炭素5%でインキュベートし、顕微鏡下で細胞を100倍の倍率でモニターします。細胞が80〜90%のコンフルエンシーに達したら、2ミリリットルのダルベッコリン酸緩衝生理食塩水で細胞を洗浄します。次に、2ミリリットルの0.05%トリプシンEDTAを1分間添加して細胞を解離し、続いて2ミリリットルのDMEMを加えて反応を停止します。
細胞懸濁液を100Gで3分間遠心分離し、ペレットを1ミリリットルのDMEMに再懸濁します。自動セルカウンターとセルカウントチャンバースライドを使用して細胞をカウントし、10ミリリットルのDMEMを含む新しい10センチメートルの細胞培養皿に10〜6番目の細胞を1.5倍接種します。マイトファジーアッセイのために、記載されたように細胞懸濁液を調製し、細胞懸濁液を新鮮なDMEMのミリリットル当たり10〜5細胞に1倍に希釈する。
2ミリリットルの希釈細胞懸濁液を20ミリメートルの共焦点皿に加え、皿を十字に振る。摂氏37度と5%二酸化炭素で24時間インキュベートします。原液を希釈して染料の作業溶液を調製する。
2ミリリットルのDMEMに0.2ミリモルのミトコンドリア色素と50マイクロモルのリソソーム色素をそれぞれ2マイクロリットル加え、0.2マイクロモルのミトコンドリア色素と50ナノモルのリソソーム色素の使用濃度を得ます。共焦点培養皿から培地を取り出し、細胞を覆うために1ミリリットルの染色液を加えます。細胞培養皿を摂氏37度、二酸化炭素5%で20〜30分間置きます。
共焦点顕微鏡イメージングソフトウェアのパラメータを設定します。二重励起画像の場合、488ナノメートルと543ナノメートルの順次励起を使用し、それぞれ505〜545ナノメートルと560ナノメートルを超える発光を収集します。色素を含む培地ディッシュをインキュベーターから取り出し、1ミリリットルのクレブスヘンゼライトまたはKHバッファーをディッシュに加えます。
マイトファジーを誘導するには、細胞をKHバッファー中の1マイクロモルのFCCPで室温で10分間処理し、すぐに共焦点顕微鏡を使用して細胞のイメージングに進みます。63Xオイルレンズの上部に適量のオイルを塗布します。共焦点顕微鏡のサンプルステージにサンプルを置き、対物レンズの真上に移動します。
イメージングソフトウェアを使用して、ソフトウェアインターフェイスの左上隅にある[検索]タブをクリックしてサンプルを見つけます。実験用の緑色のフィルター セットを選択します。粗調整ノブを使用して、対物レンズを上下に動かしてすばやく焦点を合わせます。
細胞サンプルが接眼レンズを通してはっきりと見えるようになったら、単一細胞の領域を検索して焦点を合わせ、視野の中心に移動します。ソフトウェアインターフェイスの左上隅にある[取得]タブをクリックして、画像を取得します。プレビュー用に 488 ナノメートルのチャンネルとフレーム解像度 1024 x 1024 のみを選択します。
左上隅にある[ライブ]タブをクリックして、ライブスキャンを開始します。視野を最もシャープに調整し、スライダーを左右に動かしてレーザー出力を調整します。露出オーバーを避けるために、ゲイン設定を600未満に保ちます。
ピンホール値を156に、ゲイン値を545に、デジタルオフセット値をゼロに調整します。最適な視野を選択し、2つのチャンネルを確認して、フレーム解像度1024 x 1024を選択します。[スナップ]をクリックして2D画像を取得し、取得した画像を保存します。
この研究では、FFCPを使用して、共焦点イメージングのためにMEF細胞のマイトファジーをトリガーしました。ミトコンドリアを示す緑色蛍光ミトコンドリア色素で染色した細胞と、リソソームを示す赤色蛍光リソソーム色素で染色した細胞の代表的な画像を示します。損傷した緑色染色ミトコンドリアが赤色染色されたリソソームに飲み込まれると、緑色と赤色の蛍光が重なり合い、黄色の共局在ミトコンドリアリソソームが現れます。
黄色の点は、進行中のマイトファジーを表すこれらの共局在ミトコンドリアリソソームに対応するため、マイトファジーの程度を評価するために数えることができます。ミトコンドリアおよびリソソーム染色用の色素の作業溶液を調製し、共焦点顕微鏡でイメージングする際の適切な細胞コンフルエンシーの維持は、覚えておくべき重要なステップです。この手順は、ミトコンドリアの動態を評価するために重要なミトコンドリアの数と形態を分析するためにも使用できます。
マイトファジーはさまざまな人間の病気と密接に関連しており、この技術を使用してマイトファジーと人間の病気との関係を調べることができます。
