Cette méthode permet d’observer la mitophagie dans les cellules vivantes à l’aide d’un colorant mitochondrial vert-fluorescent perméable et d’un colorant lysosome fluorescent rouge. La mitophagie joue un rôle important dans le maintien de l’homéostasie des mitochondries et de divers aspects de la fonction cellulaire. Cette technique pourrait fournir une nouvelle approche pour le traitement des maladies liées aux mitochondries.
Cette procédure n’est pas très compliquée. La capture d’images claires est très importante pour compter la superposition de mitochondries et de lysosomes. Pour commencer, cultivez des cellules embryonnaires de fibroblastes embryonnaires ou de MEF de souris dans une boîte de culture cellulaire de 10 centimètres avec 10 millilitres de milieu Eagle modifié de Dulbecco ou DMEM.
Incuber à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone et surveiller les cellules au microscope à un grossissement de 100X. Lorsque les cellules atteignent 80 à 90% de confluence, lavez-les avec deux millilitres de solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco. Ajoutez ensuite deux millilitres d’EDTA à 0,05% de trypsine pendant une minute pour dissocier les cellules, suivis de deux millilitres de DMEM pour arrêter la réaction.
Centrifuger la suspension cellulaire à 100 G pendant trois minutes et remettre en suspension la pastille dans un millilitre de DMEM. Comptez les cellules à l’aide d’un compteur de cellules automatisé et de lames de chambre de comptage de cellules et inoculez 1,5 fois 10 aux sixièmes cellules dans une nouvelle boîte de culture cellulaire de 10 centimètres contenant 10 millilitres de DMEM. Pour le test de mitophagie, préparer une suspension cellulaire comme décrit et diluer la suspension cellulaire à une fois 10 à la cinquième cellule par millilitre de DMEM frais.
Ajouter deux millilitres de la suspension cellulaire diluée à un plat confocal de 20 millimètres et agiter le plat en croix. Incuber à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone pendant 24 heures. Préparer les solutions de travail des colorants en diluant les solutions mères.
Ajouter deux microlitres chacun de colorant mitochondrial 0,2 millimolaire et 50 colorant lysosome micromolaire à deux millilitres de DMEM pour obtenir une concentration de travail de 0,2 colorant mitochondrial micromolaire et 50 colorant lysosome nanomolaire. Retirer le milieu de la capsule de culture confocale et ajouter un millilitre de solution de coloration pour couvrir les cellules. Placez la boîte de culture cellulaire à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone pendant 20 à 30 minutes.
Définissez les paramètres du logiciel d’imagerie par microscopie confocale. Pour les images à double excitation, utilisez une excitation séquentielle à 488 nanomètres et 543 nanomètres et collectez les émissions à 505 à 545 nanomètres et supérieures à 560 nanomètres respectivement. Retirez le milieu de culture contenant le colorant de l’incubateur et ajoutez un millilitre de tampon Krebs-Henseleit ou KH à la boîte.
Pour induire la mitophagie, traiter les cellules avec FCCP à une micromolaire dans un tampon KH pendant 10 minutes à température ambiante et procéder immédiatement à l’imagerie des cellules à l’aide du microscope confocale. Appliquez une quantité appropriée d’huile sur le dessus de la lentille d’huile 63X. Placez l’échantillon sur l’étage d’échantillonnage du microscope confocal et déplacez-le directement au-dessus de la lentille de l’objectif.
Utilisez le logiciel d’imagerie pour trouver l’échantillon en cliquant sur l’onglet Localiser dans le coin supérieur gauche de l’interface du logiciel. Sélectionnez un jeu de filtres vert pour l’expérience. Utilisez le bouton de réglage grossier pour effectuer rapidement la mise au point en déplaçant l’objectif de haut en bas.
Une fois que l’échantillon de cellule est clairement visible à travers l’oculaire, recherchez et concentrez la zone des cellules individuelles et déplacez-la vers le centre du champ de vision. Cliquez sur l’onglet Acquisition dans le coin supérieur gauche de l’interface du logiciel pour acquérir des images. Sélectionnez uniquement le canal de 488 nanomètres et la résolution d’image 1024 par 1024 pour la prévisualisation.
Cliquez sur l’onglet En direct dans le coin supérieur gauche pour lancer une analyse en direct. Ajustez le champ de vision au maximum et réglez la puissance laser en déplaçant le curseur vers la gauche ou la droite. Maintenez le réglage de gain en dessous de 600 pour éviter la surexposition.
Ajustez la valeur du sténopé à 156, la valeur du gain à 545 et la valeur du décalage numérique à zéro. Sélectionnez le meilleur champ de vision, vérifiez les deux canaux et choisissez la résolution d’image 1024 par 1024. Cliquez sur Snap pour acquérir des images 2D et enregistrer les images acquises.
Dans cette étude, FFCP a été utilisé pour déclencher la mitophagie dans les cellules MEF pour l’imagerie confocale. Des images représentatives de cellules colorées avec le colorant mitochondrial fluorescent vert montrant les mitochondries et colorées avec le colorant lysosome fluorescent rouge montrant le lysosome sont montrées ici. Lorsque les mitochondries colorées en vert endommagées sont englouties par des lysosomes colorés en rouge, la fluorescence verte et rouge se chevauche pour révéler des lysosomes mitochondries co-localisés jaunes.
Les points jaunes correspondent à ces lysosomes mitochondriaux co-localisés représentant la mitophagie en cours et peuvent donc être comptés pour évaluer l’étendue de la mitophagie. La préparation d’une solution de travail de colorants pour la coloration des mitochondries et des lysosomes et le maintien d’une confluence cellulaire appropriée lors de l’imagerie par microscopie confocale sont des étapes clés à retenir. Cette procédure peut également être utilisée pour analyser le nombre et la morphologie mitochondriales, ce qui est important pour évaluer la dynamique mitochondriale.
La mitophagie est étroitement associée à une variété de maladies humaines et cette technique peut être utilisée pour explorer le lien entre la mitophagie et les maladies humaines.
