Este método ajuda a observar a mitofagia em células vivas usando um corante de mitocôndrias verde-fluorescente persignificado celular e um corante lisossomo vermelho-fluorescente. A mitofagia desempenha um papel importante na manutenção da homeostase das mitocôndrias e em vários aspectos da função celular. Esta técnica poderia fornecer uma nova abordagem para o tratamento de doenças relacionadas às mitocôndrias.
Este procedimento não é muito complicado. Capturar imagens claras é muito importante para contar a sobreposição de mitocôndrias e lisossomos. Para começar, cultive fibroblastos embrionários de camundongos ou células MEF em uma placa de cultura de células de 10 centímetros com 10 mililitros de meio de águia modificado ou DMEM da Dulbecco.
Incubar a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono e monitorar as células sob um microscópio com ampliação de 100X. Quando as células atingirem 80 a 90% de confluência, lave-as com dois mililitros de solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco. Em seguida, adicione dois mililitros de 0,05% de tripsina EDTA por um minuto para dissociar as células, seguido por dois mililitros de DMEM para parar a reação.
Centrifugar a suspensão da célula a 100 G durante três minutos e ressuspender o pellet em um mililitro de DMEM. Conte as células usando um contador de células automatizado e lâminas de câmara de contagem de células e inocular 1,5 vezes 10 para as sextas células em um novo prato de cultura de células de 10 centímetros contendo 10 mililitros de DMEM. Para o ensaio de mitofagia, prepare uma suspensão celular conforme descrito e dilua a suspensão celular para uma vez 10 para a quinta célula por mililitro de DMEM fresco.
Adicione dois mililitros da suspensão de células diluídas a um prato confocal de 20 milímetros e agite o prato em uma cruz. Incubar a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por 24 horas. Preparar soluções de trabalho dos corantes diluindo as soluções-estoque.
Adicione dois microlitros cada de 0,2 milimolar de corante mitocondrial e 50 corantes de lisossomo micromolar a dois mililitros de DMEM para obter uma concentração de trabalho de 0,2 corante mitocondrial micromolar e 50 corantes lisossomáticos nanomolares. Retire o meio da placa de cultura confocal e adicione um mililitro da solução de coloração para cobrir as células. Coloque o prato de cultura celular a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por 20 a 30 minutos.
Defina os parâmetros do software de imagem de microscopia confocal. Para imagens de excitação dupla, use excitação sequencial a 488 nanômetros e 543 nanômetros e colete a emissão em 505 a 545 nanômetros e maiores que 560 nanômetros, respectivamente. Retire o prato do meio de cultura que contém o corante da incubadora e adicione um mililitro de Krebs-Henseleit ou tampão KH ao prato.
Para induzir a mitofagia, trate as células com FCCP em um micromolar em tampão KH por 10 minutos à temperatura ambiente e proceda imediatamente à imagem das células usando o microscópio confocal. Aplique uma quantidade apropriada de óleo na parte superior da lente de óleo 63X. Coloque a amostra no estágio de amostra do microscópio confocal e mova-a diretamente acima da lente objetiva.
Use o software de imagem para encontrar a amostra clicando na guia Localizar no canto superior esquerdo da interface do software. Selecione um conjunto de filtros verde para o experimento. Use o botão de ajuste grosso para focar rapidamente, movendo a lente objetiva para cima e para baixo.
Depois que a amostra de célula estiver claramente visível através da ocular, procure e concentre a área de células individuais e mova-a para o centro do campo de visão. Clique na guia Aquisição no canto superior esquerdo da interface do software para adquirir imagens. Selecione apenas o canal de 488 nanômetros e a resolução de quadro 1024 por 1024 para visualização.
Clique na guia Live no canto superior esquerdo para iniciar uma verificação ao vivo. Ajuste o campo de visão para o mais nítido e ajuste a potência do laser movendo o controle deslizante para a esquerda ou para a direita. Mantenha a configuração de ganho abaixo de 600 para evitar a exposição excessiva.
Ajuste o valor do orifício para 156, ganhe o valor para 545 e o valor do deslocamento digital para zero. Selecione o melhor campo de visão, verifique os dois canais e escolha a resolução de quadros 1024 por 1024. Clique em Ajustar para adquirir imagens 2D e salvar as imagens adquiridas.
Neste estudo, o FFCP foi utilizado para desencadear mitofagia em células MEF para imagens confocais. Imagens representativas de células coradas com o corante de mitocôndrias verde-fluorescentes mostrando mitocôndrias e coradas com o corante lisossomo vermelho-fluorescente mostrando lisossomo são mostradas aqui. Quando as mitocôndrias manchadas de verde danificadas são engolidas por lisossomos manchados de vermelho, a fluorescência verde e vermelha se sobrepõe para revelar lisossomos mitocondriais amarelos colocalizados.
Os pontos amarelos correspondem a esses lisossomos mitocondriais co-localizados que representam a mitofagia em curso e, portanto, podem ser contados para avaliar a extensão da mitofagia. A preparação de uma solução funcional de corantes para mitocôndrias e coloração de lisossomos e a manutenção da confluência celular apropriada ao fazer exames de imagem com microscopia confocal são etapas fundamentais a serem lembradas. Este procedimento também pode ser usado para analisar o número mitocondrial e a morfologia, o que é importante para avaliar a dinâmica mitocondrial.
A mitofagia está intimamente associada a uma variedade de doenças humanas e esta técnica pode ser usada para explorar a conexão entre a mitofagia e as doenças humanas.
