Этот метод помогает наблюдать митофагию в живых клетках с использованием клеточного проницаемого зелено-флуоресцентного красителя митохондрий и красителя красно-флуоресцентной лизосомы. Митофагия играет важную роль в поддержании гомеостаза митохондрий и различных аспектов клеточной функции. Этот метод может обеспечить новый подход к лечению заболеваний, связанных с митохондриями.
Эта процедура не очень сложная. Захват четких изображений очень важен для подсчета наложения митохондрий и лизосом. Для начала культивируйте эмбриональные фибробласты мышей или MEF-клетки в 10-сантиметровой чашке для культивирования клеток с 10 миллилитрами модифицированной орлиной среды Dulbecco или DMEM.
Инкубируйте при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа и контролируйте клетки под микроскопом при 100-кратном увеличении. Когда клетки достигнут слияния от 80 до 90%, промыть их двумя миллилитрами фосфатного буферного физиологического раствора Dulbecco. Затем добавьте два миллилитра 0,05% трипсина ЭДТА в течение одной минуты, чтобы диссоциировать клетки, а затем два миллилитра DMEM, чтобы остановить реакцию.
Центрифугируют клеточную суспензию при 100 Г в течение трех минут и повторно суспендируют гранулу в одном миллилитре DMEM. Подсчитайте клетки с помощью автоматизированного счетчика клеток и слайдов камеры подсчета клеток и прививайте 1,5 раза 10 к шестым клеткам в новую 10-сантиметровую чашку для культуры клеток, содержащую 10 миллилитров DMEM. Для анализа митофагии подготовьте клеточную суспензию, как описано, и разбавьте клеточную суспензию до одного раза от 10 до пятой клетки на миллилитр свежего DMEM.
Добавьте два миллилитра разбавленной клеточной суспензии в 20-миллиметровую конфокальную посуду и встряхните блюдо крестиком. Инкубировать при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа в течение 24 часов. Готовят рабочие растворы красителей путем разбавления исходных растворов.
Добавьте два микролитра каждого из 0,2 миллимолярного митохондриального красителя и 50 микромолярного лизосомного красителя к двум миллилитрам DMEM для получения рабочей концентрации 0,2 микромолярного митохондриального красителя и 50 наномолярного лизосомного красителя. Удалите среду из чашки для конфокальной культуры и добавьте один миллилитр окрашивающего раствора, чтобы покрыть клетки. Поместите чашку для культивирования клеток при температуре 37 градусов цельсия и 5% углекислого газа в течение 20-30 минут.
Задайте параметры программного обеспечения для визуализации конфокальной микроскопии. Для изображений с двойным возбуждением используйте последовательное возбуждение при 488 нанометрах и 543 нанометрах и собирайте излучение при 505-545 нанометрах и более 560 нанометров соответственно. Выньте из инкубатора чашку из культуральной среды, содержащую краситель, и добавьте в блюдо один миллилитр буфера Krebs-Henseleit или KH.
Чтобы индуцировать митофагию, обработайте клетки FCCP на одном микромоляре в буфере KH в течение 10 минут при комнатной температуре и немедленно приступайте к изображению клеток с помощью конфокального микроскопа. Нанесите соответствующее количество масла на верхнюю часть масляной линзы 63X. Поместите образец на стадию образца конфокального микроскопа и переместите его непосредственно над объективом.
Используйте программное обеспечение для создания образов, чтобы найти образец, щелкнув вкладку Поиск в левом верхнем углу интерфейса программного обеспечения. Выберите зеленый фильтр для эксперимента. Используйте грубую ручку регулировки для быстрой фокусировки, перемещая объектив вверх и вниз.
После того, как образец ячейки будет хорошо виден через окуляр, выполните поиск и сфокусируйте область отдельных ячеек и переместите ее в центр поля зрения. Нажмите на вкладку «Приобретение» в левом верхнем углу программного интерфейса, чтобы получить изображения. Для предварительного просмотра выберите только 488-нанометровый канал и разрешение кадра 1024 на 1024.
Нажмите на вкладку Live в левом верхнем углу, чтобы начать сканирование в реальном времени. Отрегулируйте поле зрения до максимально четкого и отрегулируйте мощность лазера, переместив ползунок влево или вправо. Держите коэффициент усиления ниже 600, чтобы избежать чрезмерной экспозиции.
Отрегулируйте значение точечного отверстия до 156, значение усиления до 545 и значение цифрового смещения до нуля. Выберите лучшее поле зрения, проверьте два канала и выберите разрешение кадра 1024 на 1024. Нажмите кнопку Привязать, чтобы получить 2D-изображения и сохранить полученные изображения.
В этом исследовании FFCP использовался для запуска митофагии в клетках MEF для конфокальной визуализации. Здесь показаны репрезентативные изображения клеток, окрашенных зелено-флуоресцентным красителем митохондрий, показывающим митохондрии, и окрашенных краснофлуоресцентным красителем лизосомы, показывающим лизосому. Когда поврежденные зеленые митохондрии поглощаются красными лизосомами, зеленая и красная флуоресценция перекрываются, чтобы выявить желтые колокализованные лизосомы митохондрий.
Желтые точки соответствуют этим колокализованным лизосомам митохондрий, представляющим текущую митофагию, и, таким образом, могут быть подсчитаны для оценки степени митофагии. Приготовление рабочего раствора красителей для окрашивания митохондрий и лизосом и поддержание соответствующего слияния клеток при визуализации с помощью конфокальной микроскопии являются ключевыми шагами, которые необходимо запомнить. Эта процедура также может быть использована для анализа митохондриального числа и морфологии, что важно для оценки динамики митохондрий.
Митофагия тесно связана с различными заболеваниями человека, и этот метод может быть использован для изучения связи между митофагией и заболеваниями человека.
