Diese Methode hilft, Mitophagie in lebenden Zellen mit einem zellpermierten grün-fluoreszierenden Mitochondrienfarbstoff und einem rot-fluoreszierenden Lysosomenfarbstoff zu beobachten. Mitophagie spielt eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung der Mitochondrienhomöostase und verschiedener Aspekte der Zellfunktion. Diese Technik könnte einen neuen Ansatz für die Behandlung von mitochondrienbedingten Erkrankungen bieten.
Dieses Verfahren ist nicht sehr kompliziert. Die Aufnahme klarer Bilder ist sehr wichtig, um die Überlagerung von Mitochondrien und Lysosomen zu zählen. Um zu beginnen, kultivieren Sie embryonale Fibroblasten oder MEF-Zellen der Maus in einer 10 Zentimeter großen Zellkulturschale mit 10 Milliliter Dulbeccos modifiziertem Adlermedium oder DMEM.
Inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid und überwachen Sie die Zellen unter einem Mikroskop bei 100-facher Vergrößerung. Wenn die Zellen 80 bis 90% erreichenKonfluenz, waschen Sie sie mit zwei Milliliter Dulbeccos phosphatgepufferter Kochsalzlösung. Dann fügen Sie zwei Milliliter 0,05% Trypsin EDTA für eine Minute hinzu, um die Zellen zu dissoziieren, gefolgt von zwei Milliliter DMEM, um die Reaktion zu stoppen.
Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 100 G für drei Minuten und resuspendieren Sie das Pellet in einem Milliliter DMEM. Zählen Sie die Zellen mit einem automatisierten Zellzähler und Zellzählkammerobjektträgern und inokulieren Sie 1,5 mal 10 bis sechste Zellen in eine neue 10 Zentimeter große Zellkulturschale mit 10 Milliliter DMEM. Für den Mitophagie-Assay wird eine Zellsuspension wie beschrieben hergestellt und die Zellsuspension auf einmal 10 bis fünfte Zellen pro Milliliter frischem DMEM verdünnt.
Fügen Sie zwei Milliliter der verdünnten Zellsuspension in eine 20 Millimeter konfokale Schale und schütteln Sie die Schale in einem Kreuz. Bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid für 24 Stunden inkubieren. Bereiten Sie Arbeitslösungen der Farbstoffe vor, indem Sie die Stammlösungen verdünnen.
Fügen Sie zwei Mikroliter je 0,2 Millimolarer Mitochondrienfarbstoff und 50 Mikromol-Lysosomenfarbstoff zu zwei Milliliter DMEM hinzu, um eine Arbeitskonzentration von 0,2 Mikromolaren Mitochondrienfarbstoff und 50 Nanomol-Lysosomenfarbstoff zu erhalten. Entfernen Sie das Medium aus der konfokalen Kulturschale und fügen Sie einen Milliliter der Färbelösung hinzu, um die Zellen zu bedecken. Stellen Sie die Zellkulturschale bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid für 20 bis 30 Minuten.
Stellen Sie die Parameter der konfokalen Mikroskopie-Bildgebungssoftware ein. Verwenden Sie für Bilder mit doppelter Anregung die sequentielle Anregung bei 488 Nanometern und 543 Nanometern und sammeln Sie Emissionen bei 505 bis 545 Nanometern bzw. mehr als 560 Nanometern. Die Kulturmediumschale, die den Farbstoff enthält, aus dem Inkubator nehmen und einen Milliliter Krebs-Henseleit oder KH-Puffer in die Schale geben.
Um die Mitophagie zu induzieren, behandeln Sie die Zellen mit FCCP bei einem Mikromolar im KH-Puffer für 10 Minuten bei Raumtemperatur und fahren Sie sofort fort, die Zellen mit dem konfokalen Mikroskop abzubilden. Tragen Sie eine angemessene Menge Öl auf die Oberseite der 63X Öllinse auf. Legen Sie die Probe auf den Probentisch des konfokalen Mikroskops und bewegen Sie sie direkt über die Objektivlinse.
Verwenden Sie die Imaging-Software, um das Beispiel zu finden, indem Sie auf die Registerkarte Suchen in der oberen linken Ecke der Softwareoberfläche klicken. Wählen Sie einen grünen Filtersatz für das Experiment aus. Verwenden Sie den groben Einstellknopf, um schnell zu fokussieren, indem Sie das Objektiv nach oben und unten bewegen.
Nachdem die Zellprobe durch das Okular gut sichtbar ist, suchen und fokussieren Sie den Bereich einzelner Zellen und bewegen Sie ihn in die Mitte des Sichtfeldes. Klicken Sie auf die Registerkarte Erfassung in der oberen linken Ecke der Softwareoberfläche, um Bilder aufzunehmen. Wählen Sie nur den 488-Nanometer-Kanal und die Bildauflösung 1024 x 1024 für die Vorschau aus.
Klicken Sie auf die Registerkarte Live in der oberen linken Ecke, um einen Live-Scan zu starten. Stellen Sie das Sichtfeld auf das schärfste und die Laserleistung ein, indem Sie den Schieberegler nach links oder rechts bewegen. Halten Sie die Verstärkungseinstellung unter 600, um eine Überbelichtung zu vermeiden.
Stellen Sie den Lochwert auf 156, den Verstärkungswert auf 545 und den digitalen Offsetwert auf Null ein. Wählen Sie das beste Sichtfeld, überprüfen Sie die beiden Kanäle und wählen Sie die Bildauflösung 1024 x 1024. Klicken Sie auf Ausrichten, um 2D-Bilder aufzunehmen und die aufgenommenen Bilder zu speichern.
In dieser Studie wurde FFCP verwendet, um Mitophagie in MEF-Zellen für die konfokale Bildgebung auszulösen. Repräsentative Bilder von Zellen, die mit dem grün-fluoreszierenden Mitochondrienfarbstoff gefärbt sind, der Mitochondrien zeigt und mit dem rot fluoreszierenden Lysosomenfarbstoff gefärbt ist, der Lysosomen zeigt, sind hier gezeigt. Wenn beschädigte grün gefärbte Mitochondrien von rot gefärbten Lysosomen verschlungen werden, überlappen sich die grüne und rote Fluoreszenz, um gelbe co-lokalisierte Mitochondrien-Lysosomen zu enthüllen.
Die gelben Punkte entsprechen diesen kolokalisierten Mitochondrien-Lysosomen, die eine laufende Mitophagie darstellen und können daher gezählt werden, um das Ausmaß der Mitophagie zu bewerten. Die Herstellung einer funktionierenden Lösung von Farbstoffen für Mitochondrien und Lysosomenfärbung und die Aufrechterhaltung einer geeigneten Zellkonfluenz bei der Bildgebung mit konfokaler Mikroskopie sind wichtige Schritte, an die man sich erinnern sollte. Dieses Verfahren kann auch zur Analyse der mitochondrialen Anzahl und Morphologie verwendet werden, was für die Beurteilung der mitochondrialen Dynamik wichtig ist.
Mitophagie ist eng mit einer Vielzahl von menschlichen Krankheiten verbunden und diese Technik kann verwendet werden, um den Zusammenhang zwischen Mitophagie und menschlichen Krankheiten zu erforschen.
