随着人们对细胞疗法的兴趣日益浓厚，需要新的方法来评估这些细胞的功能。该协议允许在体外长期评估这些细胞植入到神经环境中的情况。这种技术的主要优点是所有成分都来自人类。
此外，可以很容易地跟踪植入，并且可以很容易地改变类器官的环境，从而可以测试不同的药物或治疗方法。展示这项技术的将是我实验室的一位才华横溢的博士生伊利亚娜·伊巴涅斯（Iliana Ibanez）。首先从冰中取出诱导多能干细胞或iPSC衍生的神经祖细胞（NPC）的单细胞悬浮液，并在4摄氏度下以300g离心5分钟。
除去上清液，将细胞沉淀重悬于每毫升3毫克的溶解基底膜基质中，以获得每次注射2微升的最终体积。立即将悬架放回冰上直至使用。将预冷的注射器从 20 摄氏度的冰箱转移到冰桶中以备进一步使用。
接下来，从培养箱中取出脑类器官板，并使用宽孔尖端将类器官转移到35毫米的培养皿中。为了稳定类器官并促进注射，在不损坏类器官的情况下尽可能去除培养基。将含有类器官的 35 毫米培养皿置于解剖显微镜下以方便注射。
类器官准备好注射后，使用冷却的 P20 移液器吸头轻轻重悬 EGFP 标记的 NPC 细胞，并将这些细胞的两微升移动到预冷的无菌载玻片上。从冰中取出预先填充的胰岛素注射器，缓慢抽取 2 微升细胞悬浮液，针头斜面朝下。在将显微镜聚焦在装有类器官的培养皿上之前，打开其盖子。
用一只手握住盘子，将针的斜面朝上。另一方面，将细胞缓慢注入类器官表面。注射细胞后，将盖子放回培养皿中，将注射的类器官孵育一到两分钟。
然后，在将类器官转移到具有宽孔尖端的 24 孔板中之前，将 500 μL 类器官培养基轻轻加入板中。将类器官在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下孵育，每隔一天更换一次完全培养基。在荧光显微镜中加载未注射或阴性对照类器官。
并将照明强度设置在 1 到 2 之间，曝光时间设置在 80 到 100 毫秒之间，以实现最小的自发荧光。接下来，加载阳性对照类器官并增加暴露时间，以确保标记的细胞可见。用宽口径移液器吸头重新定位类器官，以找到增强的绿色荧光蛋白或EGFP加区域进行注射。
在加载类器官之前，将培养基完全从类器官中取出。并使用选定的设置对其进行成像。成像完成后，立即添加新鲜培养基以防止类器官变干。
对所有类器官重复培养基去除和成像后，将类器官恢复正常孵育和培养基更换。以所需的间隔重复成像。将载玻片放入装满甲苯的Coplin载玻片染色罐中两分钟，然后重复此步骤。
然后，将载玻片转移到装有100%乙醇的玻璃Coplin载玻片染色罐中两分钟。重复此步骤，然后将载玻片转移到装满水的 Coplin 罐中两分钟。用水重复洗涤。
然后，将塑料容器放入水浴中，确保塑料不会接触浴池底部。将柠檬酸盐缓冲液倒入塑料容器内，使其达到 95 至 100 摄氏度。缓冲液达到所需温度后，将载玻片放入缓冲液内，并用盖子松散地盖住容器，将载玻片留在水浴中 30 至 40 分钟。
孵育后，将塑料容器从水浴中取出，在室温下冷却20分钟。用PBS清洗载玻片三次，每次两分钟。用纸巾取出PBS，不要接触样品。
准备透化缓冲液并用它填充载玻片染色罐。将载玻片浸入透化缓冲液中并孵育 10 分钟。重复三次PBS洗涤，每次两分钟。
然后，准备染色混合物以覆盖每个样品，并在室温下孵育载玻片一小时之前向类器官载玻片中加入25μL。孵育后，重复三次洗涤PBS，每次洗涤两分钟，并通过在载玻片染色罐内用蒸馏水冲洗载玻片除去盐分。接下来，在使用荧光显微镜对载玻片进行成像之前，向每个样品中加入 10 微升液体支架和 DAPI。
在装有2X淬灭缓冲液的玻璃Coplin染色罐中，加入45毫升PBS，然后将载玻片放入该罐中。将罐子在 4 摄氏度下孵育过夜。在重复染色和成像之前，使用荧光显微镜检查荧光团是否被有效淬灭。
GFP荧光在输入细胞数量上存在明显的剂量依赖性，在10， 000个及以上的细胞中，EGFP加细胞贴片检测一致。注射的类器官和对照组的EGFP阳性成像显示，在整个四个月的跟踪期内，注射部位的持续存在。移植后 9 天出现额外的 EGFP 阳性细胞斑块，并持续到研究终点，表明细胞在其新位点的迁移和整合。
在更高的放大倍率下，可以观察到清晰的神经形态，长投影到类器官中，证实了注射细胞的整合。最初的单轮染色证实了注射部位存在 EGFP 加细胞，包括保留 NPC 状态的细胞和向神经命运分化的细胞的混合物。对于对照组和注射类器官，观察到很少的 Nestin 加 NPC，大多数 TUJ1 加未成熟的成熟神经元。
两轮染色提供了更多的细节，揭示了类器官大部分外部区域周围的成熟神经元，中间有未成熟神经元的区域。星形胶质细胞存在于注射和对照类器官中，并散布在外边缘周围。在注射的类器官中进行两轮染色的切片显示，EGFP和远离注射部位的细胞的小型卫星集落，这些细胞采用了成熟神经元的表型。
其中一些菌落似乎靠近星形胶质细胞。然而，没有与GFP染色完全重叠的EGFP加细胞表明它们是相邻的，而不是产生星形胶质细胞本身。当你注射类器官时，你必须避免施加太大的力或做得太快，因为你可以完全破坏类器官。
因此，在生命追踪之后，类器官可以关联并用于流式细胞术分析或单细胞测序方法。这将使我们能够了解细胞的分子状态。该技术对于推进神经退行性疾病的细胞治疗非常有用，也可用于模拟脑肿瘤或转移瘤。
