Avec l’intérêt croissant pour les thérapies cellulaires, de nouvelles méthodes pour évaluer la fonctionnalité de ces cellules sont nécessaires. Ce protocole permet une évaluation in vitro à long terme de ces greffes cellulaires dans un contexte neuronal. Le principal avantage de cette technique est que tous les composants proviennent d’une origine humaine.
En outre, la greffe peut être facilement suivie et l’environnement de l’organoïde peut être facilement modifié, ce qui permet de tester différents médicaments ou types de traitements. La démonstration de cette technique sera faite par Iliana Ibanez, une doctorante talentueuse de mon laboratoire. Commencez par retirer de la glace la suspension unicellulaire de cellules souches pluripotentes induites ou de cellules progénitrices neurales dérivées d’iPSC, ou NPC, et centrifugez-les à 300 g pendant cinq minutes à 4 degrés Celsius.
Retirer le surnageant et remettre en suspension la pastille cellulaire dans 3 milligrammes par millilitre de matrice de membrane basale solubilisée pour obtenir un volume final de deux microlitres par injection. Remettez immédiatement la suspension sur la glace jusqu’à utilisation. Transférez la seringue pré-réfrigérée du congélateur à 20 degrés Celsius dans un seau à glace pour une utilisation ultérieure.
Ensuite, retirez la plaque d’organoïde cérébral de l’incubateur et transférez-le dans une boîte de 35 millimètres à l’aide d’une pointe à large alésage. Pour stabiliser les organoïdes et faciliter l’injection, retirez le milieu autant que possible sans endommager l’organoïde. Placez la boîte de 35 millimètres contenant l’organoïde sous un microscope à dissection pour faciliter l’injection.
Une fois que les organoïdes sont prêts à être injectés, remettre doucement en suspension les cellules NPC marquées EGFP à l’aide d’une pointe de pipette P20 réfrigérée, et déplacer deux microlitres de ces cellules sur une lame de verre stérile pré-refroidie. Prenez une seringue à insuline préremplie dans la glace et aspirez lentement les 2 microlitres de suspension cellulaire avec le biseau de l’aiguille vers le bas. Ouvrez le couvercle de la boîte contenant l’organoïde avant de focaliser le microscope dessus.
Tenez le plat d’une main, placez le biseau de l’aiguille vers le haut. Et de l’autre main, injectez lentement la cellule dans la surface de l’organoïde. Après avoir injecté les cellules, remettez le couvercle dans la boîte et incubez l’organoïde injecté pendant une à deux minutes.
Ensuite, ajoutez doucement 500 microlitres de milieu organoïde à la plaque avant de transférer l’organoïde dans une plaque de 24 puits avec une pointe à large alésage. Incuber l’organoïde à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone avec un changement complet de milieu tous les deux jours. Chargez un organoïde non injecté ou de contrôle négatif dans un microscope à fluorescence.
Et réglez l’intensité d’éclairage entre 1 et 2 et le temps d’exposition entre 80 et 100 millisecondes pour une autofluorescence minimale. Ensuite, chargez l’organoïde témoin positif et augmentez le temps d’exposition pour vous assurer que les cellules marquées sont visibles. Repositionnez l’organoïde avec une pointe de pipette à large diamètre pour trouver la protéine fluorescente verte améliorée ou la région EGFP plus pour l’injection.
Retirez complètement le milieu de l’organoïde avant de charger l’organoïde. Et imaginez-le avec les paramètres sélectionnés. Une fois l’imagerie terminée, ajoutez immédiatement un milieu frais pour éviter que l’organoïde ne se dessèche.
Après avoir répété le retrait du milieu et l’imagerie de tous les organoïdes, remettre les organoïdes à l’incubation normale et changer de milieu. Répétez l’imagerie aux intervalles souhaités. Placez la lame dans un bocal de coloration de diapositive Coplin rempli de toluène pendant deux minutes et répétez cette étape.
Ensuite, transférez la lame de verre dans un bocal de coloration de diapositive en verre Coplin rempli d’alcool éthylique à 100 % pendant deux minutes. Et répétez cette étape avant de transférer la lame dans un bocal Coplin rempli d’eau pendant deux minutes. Répétez le lavage à l’eau.
Ensuite, placez un récipient en plastique dans le bain-marie, en veillant à ce que le plastique ne touche pas le fond du bain. Versez le tampon de citrate à l’intérieur du récipient en plastique et laissez-le atteindre 95 à 100 degrés Celsius. Une fois que le tampon atteint la température souhaitée, placez les lames à l’intérieur du tampon et couvrez sans serrer le récipient avec un couvercle, en laissant les lames à l’intérieur du bain-marie pendant 30 à 40 minutes.
Après l’incubation, retirez le récipient en plastique du bain-marie et laissez-le refroidir à température ambiante pendant 20 minutes. Lavez les lames trois fois pendant deux minutes chacune avec du PBS. Retirez le PBS avec un mouchoir en papier sans toucher l’échantillon.
Préparez le tampon de perméabilisation et remplissez-en un bocal de coloration pour lames de verre. Plongez les lames dans le tampon de perméabilisation et incubez pendant 10 minutes. Répétez trois lavages de PBS pendant deux minutes chacun.
Ensuite, préparez un mélange de coloration pour couvrir chaque échantillon et ajoutez 25 microlitres à la lame organoïde avant d’incuber la lame à température ambiante pendant une heure. Après l’incubation, répétez trois lavages de PBS pendant deux minutes chacun et éliminez les sels en rinçant la lame avec de l’eau distillée à l’intérieur d’un bocal de coloration en verre. Ensuite, ajoutez 10 microlitres de supports liquides et de DAPI à chaque échantillon avant d’imager la lame à l’aide du microscope à fluorescence.
Dans le bocal de coloration Coplin en verre rempli à moitié de tampon de trempe 2X, ajoutez 45 millilitres de PBS et placez les lames à l’intérieur de ce pot. Incuber le pot pendant la nuit à 4 degrés Celsius. Utilisez la microscopie à fluorescence pour vérifier si les fluorophores ont été efficacement éteints avant de répéter la coloration et l’imagerie.
Une dépendance claire de la dose de fluorescence GFP était présente sur le nombre de cellules d’entrée, avec une détection constante de l’EGFP et des patchs cellulaires à 10 000 cellules et plus. Les organoïdes injectés et les témoins imagés pour la positivité de l’EGFP ont montré la persistance du site injecté tout au long de la période de suivi de quatre mois. D’autres patchs cellulaires positifs à l’EGFP sont apparus neuf jours après la transplantation et ont persisté jusqu’au point final de l’étude, indiquant la migration des cellules et leur intégration à leurs nouveaux sites.
À un grossissement plus élevé, une morphologie neurale claire était observable avec de longues projections dans l’organoïde, confirmant l’intégration des cellules injectées. La coloration initiale en un seul tour a confirmé la présence de cellules EGFP plus au site d’injection, y compris un mélange de cellules conservant le statut de NPC et de cellules qui s’étaient différenciées vers un destin neural. Pour les organoïdes témoins et injectés, très peu de Nestin et de NPC ont été observés, avec une majorité de TUJ1 et de neurones matures immatures.
Les deux colorations rondes ont donné plus de détails, révélant des neurones matures autour de la majeure partie de la région externe de l’organoïde, avec des zones de neurones immatures vers le milieu. Les astrocytes étaient présents dans les organoïdes injectés et témoins, et étaient intercalés sur les bords extérieurs. La tranche pour laquelle la coloration à deux rondes a été réalisée dans l’organoïde injecté a montré une petite colonie satellite d’EGFP plus des cellules éloignées du site d’injection qui avait adopté le phénotype des neurones matures.
Certaines de ces colonies semblent être proches des astrocytes. Cependant, aucune cellule EGFP plus avec un chevauchement complet de la coloration GFP suggère qu’elles étaient adjacentes plutôt que de générer les astrocytes eux-mêmes. Lorsque vous injectez l’organoïde, vous devez éviter d’appliquer trop de force ou de le faire trop rapidement, car vous pouvez détruire complètement l’organoïde.
Ainsi, après le suivi de la vie, les organoïdes peuvent être associés et utilisés pour l’analyse par cytométrie en flux ou les approches de séquençage de cellules uniques. Cela nous permettra de connaître l’état moléculaire des cellules. Cette technique pourrait être extrêmement utile pour faire progresser la thérapie cellulaire pour les maladies neurodégénératives, également pour modéliser les tumeurs cérébrales ou les métastases.
