Mit dem wachsenden Interesse an Zelltherapien werden neue Methoden zur Bewertung der Funktionalität dieser Zellen benötigt. Dieses Protokoll ermöglicht eine In-vitro-Langzeitbewertung dieser Zelltransplantation in einem neuronalen Kontext. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass alle Komponenten menschlichen Ursprungs sind.
Außerdem kann die Transplantation leicht verfolgt werden, und die Umgebung des Organoids kann leicht verändert werden, was das Testen verschiedener Medikamente oder Behandlungen ermöglicht. Diese Technik wird von Iliana Ibanez, einer talentierten Doktorandin in meinem Labor, demonstriert. Beginnen Sie damit, die Einzelzellsuspension von induzierten pluripotenten Stammzellen oder iPSC-abgeleiteten neuralen Vorläuferzellen (NPCs) aus dem Eis zu entfernen und sie fünf Minuten lang bei 300 g bei 4 Grad Celsius zu zentrifugieren.
Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in 3 Milligramm pro Milliliter gelöster Basalmembranmatrix, um ein Endvolumen von zwei Mikrolitern pro Injektion zu erhalten. Legen Sie die Suspension sofort wieder auf das Eis, bis sie verwendet wird. Übertragen Sie die vorgekühlte Spritze aus dem 20-Grad-Gefrierschrank zur weiteren Verwendung in einen Eiskübel.
Nehmen Sie als Nächstes die Gehirnorganoidplatte aus dem Inkubator und geben Sie das Organoid mit einer breiten Spitze in eine 35-Millimeter-Schale. Um die Organoide zu stabilisieren und die Injektion zu erleichtern, entfernen Sie das Medium so weit wie möglich, ohne das Organoid zu beschädigen. Legen Sie die 35-Millimeter-Schale mit dem Organoid unter ein Präpariermikroskop, um die Injektion zu erleichtern.
Sobald die Organoide zur Injektion bereit sind, resuspendieren Sie die EGFP-markierten NPC-Zellen vorsichtig mit einer gekühlten P20-Pipettenspitze und bewegen Sie zwei Mikroliter dieser Zellen auf einen vorgekühlten sterilen Glasobjektträger. Nehmen Sie eine vorgefüllte Insulinspritze aus dem Eis und ziehen Sie die 2 Mikroliter Zellsuspension langsam mit der Fase der Nadel nach unten nach oben. Öffnen Sie den Deckel der Schale, die das Organoid enthält, bevor Sie das Mikroskop darauf richten.
Halten Sie die Schüssel mit einer Hand fest, legen Sie die Fase der Nadel nach oben. Und mit der anderen Hand injizieren Sie die Zelle langsam in die Organoidoberfläche. Setzen Sie nach der Injektion der Zellen den Deckel wieder in die Schale und inkubieren Sie das injizierte Organoid ein bis zwei Minuten lang.
Geben Sie dann vorsichtig 500 Mikroliter des Organoidmediums in die Platte, bevor Sie das Organoid in eine 24-Well-Platte mit einer breiten Bohrungsspitze überführen. Inkubieren Sie das Organoid bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid mit einem vollständigen Mediumwechsel jeden zweiten Tag. Laden Sie ein nicht injiziertes Organoid oder ein Organoid mit Negativkontrolle in ein Fluoreszenzmikroskop.
Stellen Sie die Beleuchtungsintensität zwischen 1 und 2 und die Belichtungszeit zwischen 80 und 100 Millisekunden ein, um eine minimale Autofluoreszenz zu gewährleisten. Laden Sie als Nächstes das Positivkontrollorganoid und erhöhen Sie die Belichtungszeit, um sicherzustellen, dass markierte Zellen sichtbar sind. Positionieren Sie das Organoid mit einer Pipettenspitze mit breitem Durchgang neu, um das verbesserte grün fluoreszierende Protein oder die EGFP plus-Region für die Injektion zu finden.
Entfernen Sie das Medium vollständig aus dem Organoid, bevor Sie das Organoid laden. Und stellen Sie es mit den ausgewählten Einstellungen dar. Sobald die Bildgebung abgeschlossen ist, fügen Sie sofort ein frisches Medium hinzu, um ein Austrocknen des Organoids zu verhindern.
Nachdem Sie die Mediumentfernung und Bildgebung für alle Organoide wiederholt haben, bringen Sie die Organoide wieder in den normalen Inkubations- und Mediumwechsel. Wiederholen Sie die Bildgebung in den gewünschten Intervallen. Legen Sie den Objektträger für zwei Minuten in ein mit Toluol gefülltes Coplin-Objektträger-Färbeglas und wiederholen Sie diesen Schritt.
Übertragen Sie dann den Objektträger für zwei Minuten in ein mit 100 % Ethylalkohol gefülltes Coplin-Objektträger-Färbeglas. Wiederholen Sie diesen Schritt, bevor Sie den Objektträger für zwei Minuten in ein mit Wasser gefülltes Coplin-Glas geben. Wiederholen Sie die Wäsche mit Wasser.
Stellen Sie dann einen Plastikbehälter in das Wasserbad und stellen Sie sicher, dass der Kunststoff den Boden des Bades nicht berührt. Gießen Sie den Citratpuffer in den Plastikbehälter und lassen Sie ihn 95 bis 100 Grad Celsius erreichen. Sobald der Puffer die gewünschte Temperatur erreicht hat, legen Sie die Objektträger in den Puffer und decken Sie den Behälter locker mit einem Deckel ab, wobei Sie die Objektträger 30 bis 40 Minuten im Wasserbad belassen.
Nach der Inkubation den Plastikbehälter aus dem Wasserbad nehmen und 20 Minuten bei Raumtemperatur abkühlen lassen. Waschen Sie die Objektträger dreimal für jeweils zwei Minuten mit PBS. Entfernen Sie das PBS mit einem Papiertuch, ohne die Probe zu berühren.
Bereiten Sie den Permeabilisierungspuffer vor und füllen Sie damit ein Glasobjektträger-Färbeglas. Tauchen Sie die Objektträger in den Permeabilisierungspuffer und inkubieren Sie sie 10 Minuten lang. Wiederholen Sie drei Wäschen PBS für jeweils zwei Minuten.
Bereiten Sie dann eine Färbemischung vor, um jede Probe abzudecken, und geben Sie 25 Mikroliter in den Organoid-Objektträger, bevor Sie den Objektträger eine Stunde lang bei Raumtemperatur inkubieren. Wiederholen Sie nach der Inkubation drei Wäschen von PBS für jeweils zwei Minuten und entfernen Sie die Salze, indem Sie den Objektträger mit destilliertem Wasser in einem Glasobjektträger-Färbeglas abspülen. Als nächstes fügen Sie jeder Probe 10 Mikroliter Flüssigkeitshalterungen und DAPI hinzu, bevor Sie den Objektträger mit dem Fluoreszenzmikroskop abbilden.
In das Glas-Coplin-Färbeglas, das zur Hälfte mit 2-fachem Quenching-Puffer gefüllt ist, fügen Sie 45 Milliliter PBS hinzu und legen Sie die Objektträger in dieses Glas. Inkubieren Sie das Glas über Nacht bei 4 Grad Celsius. Verwenden Sie die Fluoreszenzmikroskopie, um zu überprüfen, ob die Fluorophore effektiv abgeschreckt wurden, bevor Sie die Färbung und Bildgebung wiederholen.
Es zeigte sich eine klare Dosisabhängigkeit der GFP-Fluoreszenz von der Anzahl der Eingangszellen, mit konsistenter EGFP plus Zellpatch-Detektion bei 10.000 Zellen und mehr. Die injizierten Organoide und Kontrollen, die auf EGFP-Positivität abgebildet wurden, zeigten die Persistenz der injizierten Stelle während des viermonatigen Tracking-Zeitraums. Weitere EGFP-positive Zellpflaster traten neun Tage nach der Transplantation auf und blieben bis zum Endpunkt der Studie bestehen, was auf die Migration der Zellen und die Integration an ihren neuen Stellen hinweist.
Bei einer höheren Vergrößerung war eine klare neuronale Morphologie mit langen Projektionen in das Organoid zu beobachten, was die Integration der injizierten Zellen bestätigte. Die anfängliche Einzelrundenfärbung bestätigte das Vorhandensein von EGFP plus-Zellen an der Injektionsstelle, einschließlich einer Mischung aus Zellen, die den NPC-Status behielten, und solchen, die sich in Richtung eines neuronalen Schicksals differenziert hatten. Für die Kontroll- und injizierten Organoide wurden nur sehr wenige Nestin plus NPCs beobachtet, mit einer Mehrheit von TUJ1 plus unreifen reifen Neuronen.
Die zweirunde Färbung ergab mehr Details und enthüllte reife Neuronen um den größten Teil der äußeren Region des Organoids, mit Bereichen unreifer Neuronen in der Mitte. Astrozyten waren in den injizierten und Kontrollorganoiden vorhanden und an den äußeren Rändern eingestreut. Der Schnitt, für den die Zwei-Rund-Färbung im injizierten Organoid durchgeführt wurde, zeigte eine kleine Satellitenkolonie von EGFP-Plus-Zellen weit entfernt von der Injektionsstelle, die den Phänotyp reifer Neuronen angenommen hatte.
Einige dieser Kolonien scheinen sich in der Nähe von Astrozyten zu befinden. Allerdings deuteten keine EGFP-plus-Zellen mit vollständiger Überlappung zur GFP-Färbung darauf hin, dass sie benachbart waren, anstatt die Astrozyten selbst zu erzeugen. Wenn Sie das Organoid injizieren, müssen Sie vermeiden, zu viel Kraft auszuüben oder es zu schnell zu tun, da Sie das Organoid vollständig zerstören können.
So können die Organoide nach der Lebensverfolgung assoziiert und für Durchflusszytometrie-Analysen oder Einzelzellsequenzierungsansätze verwendet werden. Dies wird es uns ermöglichen, den molekularen Zustand der Zellen zu kennen. Diese Technik könnte äußerst nützlich sein, um die Zelltherapie für neurodegenerative Erkrankungen voranzutreiben, auch für die Modellierung von Hirntumoren oder Metastasen.
