يصف هذا البروتوكول طريقة فعالة لعزل جريبات المبيض عن خلايا السدى المحيطة لتقييم تحليلات التعبير الجيني على هذه الخلايا الجرثومية. تسمح هذه التقنية ، باستخدام العزلات الأنزيمية والميكانيكية الخاضعة للرقابة ، باسترجاع البصيلات مع الحفاظ على سلامتها. باتباع هذا البروتوكول ، يمكن للباحث تقييم تعبيرات جينية محددة من هذه الخلايا.
يمكن استخدام هذه التقنية لفهم المزيد من العجز في التعبير الجيني في البصيلات المتعلقة بالأمراض التي تؤثر على وظيفة المبيض أو بعد التعرض للعوامل السامة. ابدأ في تحضير صفيحة من ستة آبار عن طريق إضافة خمسة ملليلتر من محلول الحماية من التبريد إلى البئر الأول وخمسة ملليلترات من وسط Leibovitz 15 مع تقليل تركيزات المواد الواقية من التبريد إلى الآبار الأربعة التالية. قم بإزالة قارورة تحتوي على جزء قشري مبيض من النيتروجين السائل وفقا لقواعد السلامة.
بعد 30 ثانية في درجة حرارة الغرفة ، أو RT ، انقع القارورة في ماء مقطر مزدوج لمدة دقيقتين. داخل غطاء عمودي ، حرك برفق وافتح قارورة الجزء القشري المبيض قبل نقل المحتوى إلى البئر الأول من الصفيحة المكونة من ستة آبار الموضوعة على الجليد. بعد ذلك ، انقل الجزء القشري المبيضي في البئر الأول على التوالي إلى كل بئر من الصفيحة ذات الستة آبار التي تحتوي على تركيزات متناقصة من مادة الحماية من البرودة في خمسة ملليلتر من وسط Leibovitz 15.
حرك الأنسجة برفق في كل وسط لمدة خمس دقائق. لعزل الجريب ، انقل أنسجة المبيض المذابة إلى طبق بتري شبكي بطول مليمترين مملوء ب 10 ملليلتر من وسط التشريح ، و 30 ميكروغرام لكل مليلتر من البنسلين G ، و 50 ميكروغرام لكل ملليلتر من الستربتومايسين. اضبط حجم الأنسجة باستخدام المشرط ، إذا لزم الأمر.
كومة القطع الثلاث من قطاعة الأنسجة ووضع جزء المبيض بين كتلتين. قطع الجزء إلى النصف باستخدام شفرة ، والانزلاق من خلال الكتل للحصول على شظيتين بسمك 0.5 ملم. قطع الأنسجة باستخدام مفرمة الأنسجة للحصول على القطع الصغيرة.
إذا لزم الأمر ، قم بقص القطع المتبقية يدويا باستخدام المشرط حتى يتم تحطيم الأنسجة. بمجرد تحطيم الأنسجة ، انقل الأنسجة المجزأة إلى طبق بتري شبكي مملوء بسبعة ملليلتر من وسط الهضم قبل وضع الطبق في الحاضنة عند 5٪ ثاني أكسيد الكربون و 37 درجة مئوية. خذ طبق بتري من الحاضنة كل 10 دقائق.
اغسل الأنسجة عن طريق سحب وسط الهضم لأعلى ولأسفل باستخدام ماصة سعة ملليلتر واحد. بعد 45 دقيقة من الحضانة في وسط الهضم ، ضع الطبق تحت مجهر ستيريو مع نطاق تكبير من خمس إلى 6.3 مرات واسترد البصيلات باستخدام ماصة شعرية دقيقة. حدد بصيلات الاهتمام وعزلها عن طريق امتصاصها باستخدام ماصة الفم.
إذا ظلت البصيلات عالقة في قطعة من القشرة ، فقم بعزلها ميكانيكيا باستخدام حقنتين من عيار 27 عن طريق تمزيق القشرة بطرف المحاقن وإطلاق بصيلات من السدى. باستخدام الشعيرات الدموية الدقيقة ، انقل البصيلات المعزولة إلى صفيحة من أربعة آبار تحتوي على 15 ميكرولترا من وسط الاستزراع المعاير المغطى ب 500 ميكرولتر من ثقافة الزيت. بعد نقل واحد إلى 10 بصيلات ، اشطفها مرتين في قطرتين من 15 ميكرولتر من PBS مغطاة ب 500 ميكرولتر من ثقافة الزيت لمدة خمس ثوان لكل منهما.
باستخدام ماصة الفم ، اجمع 20 بصيلة مع الحد الأدنى من برنامج تلفزيوني في أنبوب فارغ واحتفظ بالأنبوب على الجليد. بعد 90 دقيقة من الحضانة في وسط الهضم ، أوقف التفاعل الأنزيمي عن طريق إضافة محلول مانع بارد. تحت الغطاء الكيميائي ، قم بتعليق البصيلات المعزولة في 100 ميكرولتر من محلول التحلل المزود بمجموعة استخراج الحمض النووي الريبي.
دوامة البصيلات المعزولة بسرعة 2500 دورة في الدقيقة لكسر هيكلها ، ثم أضف 50 ميكرولترا من الإيثانول بنسبة 100٪ إلى الأنبوب. ولفترة وجيزة دوامة الأنبوب بسرعة عالية. بعد الدوامة ، انقل الحجم الكلي للأنبوب إلى مجموعة خرطوشة مرشح دقيق ، تتكون من عمود وأنبوب تجميع.
وأجهزة الطرد المركزي التجمع لمدة 10 ثوان في 16،363g عند أربع درجات مئوية. اغسل العمود ب 180 ميكرولترا من محلول الغسيل 1 المزود مع المجموعة قبل الطرد المركزي للأنبوب لمدة 10 ثوان. بعد إعطاء غسلتين من 180 ميكرولتر من محلول الغسيل 2 ، 3 إلى العمود ، جفف الفلتر عن طريق الطرد المركزي للأنبوب مرة أخيرة وضع أنبوب تجميع جديد أسفل الخرطوشة.
لإجراء شطف الأحماض النووية ، أضف أولا ثمانية ميكرولترات من محلول الشطف 75 درجة مئوية إلى مجموعة المرشح. بعد دقيقة واحدة ، جهاز الطرد المركزي التجميع لمدة 30 ثانية. كرر هذه الخطوة بسبعة ميكرولترات من محلول الشطف.
بمجرد الانتهاء من ذلك ، أضف وحدتين دوليتين DNase و DNase buffer إلى الأنبوب واحتضان الأنبوب لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية. منع النشاط الأنزيمي مع واحد × 10 كاشف تعطيل DNase لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، قم بطرد الأنبوب لمدة 1.5 دقيقة عند 16،363 جم عند أربع درجات مئوية ونقل التعليق الذي يحتوي على الحمض النووي الريبي إلى أنبوب جديد.
باستخدام مقياس الطيف الضوئي ، قم بتقييم كمية الحمض النووي الريبي في العينة. استخدم محلول شطف ميكرولتر واحد كمحلول فارغ وميكرولتر واحد من الحمض النووي الريبي المستخرج من بصيلات معزولة. تحقق مما إذا كانت نسبة 260/280 حوالي 2.0 لنقاء الحمض النووي الريبي.
وقم بتخزين العينة في درجة حرارة 80 درجة مئوية تحت الصفر أو نسخها مباشرة لإجراء RT-qPCR. باستخدام هذا البروتوكول ، تمت معالجة شظيتين متجانستين من المبيض 4x2x1 ملليمتر من نفس المريض لعزل البصيلات. كشف القياس الكمي للحمض النووي الريبي أنه تم استخراج 4.8 نانوجرام لكل ميكرولتر من إجمالي الحمض النووي الريبي من بصيلات يقل حجمها عن 75 ميكرومتر بنسبة نقاء 1.89.
من بصيلات أقل من 200 ميكرومتر ، تم استخراج 10.5 نانوجرام لكل ميكرولتر من إجمالي الحمض النووي الريبي بنسبة نقاء 1.74. كانت قيم رقم سلامة الحمض النووي الريبي ، أو RIN ، 7.1 و 7.9 في الأنبوبين الأول والثاني على التوالي للتحقق من جودة الحمض النووي الريبي من عيناتنا. بعد تشغيل دورة قياسية على نظام تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي ، كانت عتبات الدورة ، أو CT ، التي تم الحصول عليها 30.87 و 29.56 ل HPRT ، و 33.5 و 31.77 ل kit ligand ، و 30.71 و 30.57 ل GDF9.
الهضم الأنزيمي للأنسجة هو نقطة حرجة. يجب على المجرب أن يقيم باستمرار ويضمن سلامة الجريب أثناء التفاعل عن طريق إيقافه عند الضرورة. إلى جانب تحليلات التعبير الجيني ، تستخدم الجريبات المعزولة لتطوير أنظمة تجريبية للحفاظ على خصوبة مرضى السرطان ، مثل الجريب في مزرعة المختبر أو المبيض الاصطناعي.
تتطلب تقنية العزل منحنى تعليمي لاسترجاع عدد كبير من البصيلات السليمة. ينصح الباحثون بالتأكد من تحطيم الأنسجة جيدا قبل الهضم.
