Ce protocole décrit une méthode efficace pour isoler les follicules ovariens des cellules stroma environnantes afin d’évaluer les analyses d’expression génique sur ces cellules germinales. Cette technique, utilisant des isolations enzymatiques et mécaniques contrôlées, permet de récupérer les follicules tout en maintenant leur intégrité. En suivant ce protocole, le chercheur peut évaluer des expressions géniques spécifiques à partir de ces cellules.
La technique pourrait être utilisée pour mieux comprendre le déficit d’expression génique dans les follicules lié à des maladies affectant la fonction ovarienne ou après une exposition à des agents toxiques. Commencez à préparer une plaque de six puits en ajoutant cinq millilitres de solution cryoprotectrice au premier puits et cinq millilitres de milieu Leibovitz 15 avec des concentrations décroissantes de cryoprotecteur aux quatre puits suivants. Retirer un flacon contenant un fragment cortical ovarien de l’azote liquide conformément aux règles de sécurité.
Après 30 secondes à température ambiante, ou RT, faire tremper le flacon dans de l’eau distillée double pendant deux minutes. À l’intérieur d’une hotte verticale, agiter doucement et ouvrir le flacon de fragments corticaux ovariens avant de transférer le contenu dans le premier puits de la plaque de six puits placée sur de la glace. Ensuite, transférer successivement le fragment cortical ovarien dans le premier puits dans chaque puits de la plaque de six puits contenant des concentrations décroissantes de cryoprotecteur dans cinq millilitres de milieu Leibovitz 15.
Agitez doucement le tissu dans chaque milieu pendant cinq minutes. Pour l’isolement du follicule, transférer le tissu ovarien décongelé dans une boîte de Petri quadrillée de deux millimètres remplie de 10 millilitres de milieu de dissection, de 30 microgrammes par millilitre de pénicilline G et de 50 microgrammes par millilitre de streptomycine. Ajustez la taille du tissu avec le scalpel, si nécessaire.
Empilez les trois morceaux de la trancheuse à tissu et placez le fragment ovarien entre les deux blocs. Couper le fragment en deux à l’aide d’une lame, en glissant à travers les blocs pour obtenir deux fragments de 0,5 millimètre d’épaisseur. Coupez le tissu à l’aide du hacheur de tissu pour obtenir les plus petits morceaux.
Si nécessaire, coupez les morceaux restants manuellement avec le scalpel jusqu’à ce que le tissu soit brisé. Une fois le tissu brisé, transférez le tissu fragmenté dans une boîte de Petri grillagée remplie de sept millilitres de milieu de digestion avant de placer la boîte dans l’incubateur à 5% de dioxyde de carbone et 37 degrés Celsius. Prenez la boîte de Petri de l’incubateur toutes les 10 minutes.
Rincer le tissu en pipetant le milieu digestif de haut en bas avec une pipette d’un millilitre. Après 45 minutes d’incubation dans le milieu de digestion, placer la capsule sous un stéréomicroscope avec une plage de grossissement de cinq à 6,3 fois et récupérer les follicules à l’aide d’une micro pipette capillaire. Sélectionnez les follicules d’intérêt et isolez-les en les aspirant avec une pipette buccale.
Si les follicules restent coincés dans un morceau de cortex, isolez-les mécaniquement avec deux seringues de calibre 27 en arrachant le cortex avec l’extrémité des seringues et en libérant les follicules du stroma. À l’aide du microcapillaire, transférer les follicules isolés dans une plaque à quatre puits contenant 15 microlitres du milieu de culture étalonné recouvert de 500 microlitres de culture d’huile. Après avoir transféré un à 10 follicules, rincez-les deux fois dans deux gouttes de 15 microlitres de PBS recouvertes de 500 microlitres de culture d’huile pendant cinq secondes chacune.
À l’aide de la pipette buccale, recueillir 20 follicules avec un minimum de PBS dans un tube vide et garder le tube sur de la glace. Après 90 minutes d’incubation dans le milieu digestif, arrêtez la réaction enzymatique en ajoutant une solution de blocage du froid. Sous le capot chimique, suspendre les follicules isolés dans 100 microlitres de la solution de lyse fournie avec le kit d’extraction d’ARN.
Vortex les follicules isolés à 2500 RPM par minute pour casser leur structure, puis ajouter 50 microlitres d’éthanol à 100% dans le tube. Et brièvement vortex le tube à grande vitesse. Après vortex, transférer le volume total du tube dans un ensemble de cartouches microfiltrantes, comprenant une colonne et un tube de collecte.
Et centrifuger l’ensemble pendant 10 secondes à 16, 363g à quatre degrés Celsius. Lavez la colonne avec 180 microlitres de solution de lavage 1 fournie avec le kit avant de centrifuger le tube pendant 10 secondes. Après avoir donné deux lavages de 180 microlitres de solution de lavage 2, 3 à la colonne, sécher le filtre en centrifugeant le tube une dernière fois et placer un nouveau tube de collecte sous la cartouche.
Pour effectuer l’élution des acides nucléiques, ajoutez d’abord huit microlitres de solution d’élution à 75 degrés Celsius à l’ensemble du filtre. Après une minute, centrifuger l’ensemble pendant 30 secondes. Répétez cette étape avec sept microlitres de solution d’élution.
Une fois cela fait, ajoutez deux tampons DNase et DNase d’unité internationale au tube et incuber le tube pendant 20 minutes à 37 degrés Celsius. Bloquer l’activité enzymatique avec un réactif d’inactivation de la DNase pendant deux minutes à température ambiante. Ensuite, centrifuger le tube pendant 1,5 minute à 16, 363g à quatre degrés Celsius et transférer la suspension contenant l’ARN dans un nouveau tube.
À l’aide d’un spectrophotomètre, évaluer la quantité d’ARN dans l’échantillon. Utiliser une solution d’élution de microlitre comme solution vierge et une solution de microlitre d’ARN extraite de follicules isolés. Vérifiez si le rapport 260/280 est d’environ 2,0 pour la pureté de l’ARN.
Et conservez l’échantillon à moins 80 degrés Celsius ou rétrotranscrivez-le directement pour effectuer une RT-qPCR. En utilisant ce protocole, les deux fragments ovariens homogénéisés de 4x2x1 millimètre de la même patiente ont été traités pour isoler les follicules. La quantification de l’ARN a révélé que 4,8 nanogrammes par microlitre d’ARN total ont été extraits de follicules de moins de 75 micromètres avec un rapport de pureté de 1,89.
Sur les follicules de moins de 200 micromètres, 10,5 nanogrammes par microlitre d’ARN total ont été extraits avec un rapport de pureté de 1,74. Les valeurs du nombre d’intégrité de l’ARN, ou RIN, étaient de 7,1 et 7,9 dans les tubes un et deux respectivement, validant la qualité de l’ARN de nos échantillons. Après avoir exécuté un cycle standard sur un système de PCR en temps réel, les seuils de cycle, ou CT, obtenus étaient de 30,87 et 29,56 pour HPRT, 33,5 et 31,77 pour le ligand kit, et 30,71 et 30,57 pour GDF9.
La digestion enzymatique du tissu est un point critique. L’expérimentateur doit continuellement évaluer et assurer l’intégrité du follicule pendant la réaction en l’arrêtant si nécessaire. Outre les analyses d’expression génique, des follicules isolés sont utilisés pour développer des systèmes expérimentaux visant à préserver la fertilité des patients atteints de cancer, comme la culture de follicules in vitro ou l’ovaire artificiel.
La technique d’isolement nécessitait une courbe d’apprentissage pour récupérer un grand nombre de follicules intacts. Il est conseillé aux chercheurs de s’assurer que le tissu est bien brisé avant la digestion.
