Dieses Protokoll beschreibt eine effiziente Methode, um Eierstockfollikel aus den umgebenden Stromazellen zu isolieren, um Genexpressionsanalysen an diesen Keimzellen durchzuführen. Diese Technik, bei der kontrollierte enzymatische und mechanische Isolierungen verwendet werden, ermöglicht die Entnahme von Follikeln unter Beibehaltung ihrer Integrität. Nach diesem Protokoll kann der Forscher bestimmte Genexpressionen dieser Zellen beurteilen.
Die Technik könnte verwendet werden, um das Defizit der Genexpression in den Follikeln im Zusammenhang mit Erkrankungen, die die Eierstockfunktion beeinträchtigen, oder nach Exposition gegenüber toxischen Stoffen besser zu verstehen. Beginnen Sie mit der Vorbereitung einer Sechs-Well-Platte, indem Sie fünf Milliliter Kryoprotektionslösung in die erste Vertiefung und fünf Milliliter Leibovitz 15-Medium mit abnehmenden Konzentrationen von Kryoprotektivum in die nächsten vier Vertiefungen geben. Entnehmen Sie eine Durchstechflasche, die ein kortikales Fragment der Eierstöcke enthält, unter Einhaltung der Sicherheitsvorschriften aus flüssigem Stickstoff.
Nach 30 Sekunden bei Raumtemperatur oder RT die Durchstechflasche zwei Minuten lang in doppelt destilliertem Wasser einweichen. Bewegen Sie in einer vertikalen Haube vorsichtig und öffnen Sie das Durchstechflaschen mit dem kortikalen Fragment der Eierstöcke, bevor Sie den Inhalt in die erste Vertiefung der auf Eis gelegten Sechs-Well-Platte übertragen. Dann wird das kortikale Fragment der Eierstöcke in der ersten Vertiefung nacheinander in jede Vertiefung der Sechs-Well-Platte übertragen, die abnehmende Konzentrationen von Kryoprotektivum in fünf Millilitern Leibovitz 15-Medium enthält.
Bewegen Sie das Gewebe in jedem Medium fünf Minuten lang sanft. Zur Follikelisolierung wird das aufgetaute Eierstockgewebe in eine zwei Millimeter große, gerasterte Petrischale übertragen, die mit 10 Millilitern Präpariermedium, 30 Mikrogramm pro Milliliter Penicillin G und 50 Mikrogramm pro Milliliter Streptomycin gefüllt ist. Passen Sie die Gewebegröße bei Bedarf mit dem Skalpell an.
Stapeln Sie die drei Teile des Gewebeschneiders auf und legen Sie das Eierstockfragment zwischen die beiden Blöcke. Schneiden Sie das Fragment mit einer Klinge in zwei Hälften und gleiten Sie durch die Blöcke, um zwei 0,5 Millimeter dicke Fragmente zu erhalten. Schneiden Sie das Gewebe mit dem Taschentuchzerkleinerer ab, um die kleineren Stücke zu erhalten.
Schneiden Sie bei Bedarf die restlichen Stücke manuell mit dem Skalpell ab, bis das Gewebe zerschlagen ist. Sobald das Gewebe zerschlagen ist, überführen Sie das fragmentierte Gewebe in eine gerasterte Petrischale, die mit sieben Millilitern Verdauungsmedium gefüllt ist, bevor Sie die Schale bei 5 % Kohlendioxid und 37 Grad Celsius in den Inkubator stellen. Nehmen Sie die Petrischale alle 10 Minuten aus dem Inkubator.
Spülen Sie das Gewebe, indem Sie das Aufschlussmedium mit einer Ein-Milliliter-Pipette auf und ab pipettieren. Nach 45-minütiger Inkubation im Aufschlussmedium wird die Schale unter ein Stereomikroskop mit fünf- bis 6,3-facher Vergrößerung gestellt und die Follikel mit einer Mikrokapillarpipette entnommen. Wählen Sie die interessierenden Follikel aus und isolieren Sie sie, indem Sie sie mit einer Mundpipette aufsaugen.
Wenn die Follikel in einem Stück Kortex stecken bleiben, isolieren Sie sie mechanisch mit zwei 27-Gauge-Spritzen, indem Sie die Rinde mit der Spitze der Spritzen abreißen und die Follikel aus dem Stroma lösen. Übertragen Sie die isolierten Follikel mithilfe der Mikrokapillare auf eine Vier-Well-Platte, die 15 Mikroliter des kalibrierten Nährmediums enthält, die mit 500 Mikrolitern Ölkultur bedeckt sind. Nachdem Sie einen bis 10 Follikel übertragen haben, spülen Sie sie zweimal in zwei Tropfen von 15 Mikrolitern PBS, bedeckt mit 500 Mikrolitern Ölkultur, jeweils fünf Sekunden lang.
Sammeln Sie mit der Mundpipette 20 Follikel mit minimalem PBS in einem leeren Röhrchen und bewahren Sie das Röhrchen auf Eis auf. Nach 90-minütiger Inkubation im Verdauungsmedium wird die enzymatische Reaktion durch Zugabe einer Kälteblockierlösung gestoppt. Suspendieren Sie die isolierten Follikel unter der chemischen Haube in 100 Mikrolitern der Lyselösung, die mit dem RNA-Extraktionskit geliefert wird.
Wirbeln Sie die isolierten Follikel mit 2500 U/min pro Minute, um ihre Struktur aufzubrechen, und geben Sie dann 50 Mikroliter 100%iges Ethanol in das Röhrchen. Und wirbeln Sie das Rohr kurz mit hoher Geschwindigkeit vor. Nach dem Wirbeln wird das Gesamtvolumen des Schlauchs in eine Mikrofilterpatronenbaugruppe übertragen, die aus einer Säule und einem Sammelrohr besteht.
Und zentrifugieren Sie die Baugruppe 10 Sekunden lang bei 16,363 g bei vier Grad Celsius. Waschen Sie die Säule mit 180 Mikrolitern Waschlösung 1, die im Lieferumfang des Kits enthalten sind, bevor Sie das Röhrchen 10 Sekunden lang zentrifugieren. Nachdem Sie der Säule zwei Waschgänge mit 180 Mikrolitern Waschlösung 2, 3 gegeben haben, trocknen Sie den Filter, indem Sie das Röhrchen ein letztes Mal zentrifugieren, und legen Sie ein neues Auffangröhrchen unter die Kartusche.
Um die Elution der Nukleinsäuren durchzuführen, werden zunächst acht Mikroliter 75 Grad Celsius Elutionslösung in die Filterbaugruppe gegeben. Zentrifugieren Sie die Baugruppe nach einer Minute 30 Sekunden lang. Wiederholen Sie diesen Schritt mit sieben Mikrolitern Elutionslösung.
Wenn Sie fertig sind, geben Sie zwei internationale DNase- und DNase-Puffer in das Röhrchen und inkubieren Sie das Röhrchen 20 Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Blockieren Sie die enzymatische Aktivität mit einem zu 10 DNase-Inaktivierungsreagenz für zwei Minuten bei Raumtemperatur. Als nächstes zentrifugieren Sie das Röhrchen 1,5 Minuten lang bei 16,363 g bei vier Grad Celsius und übertragen die Suspension mit der RNA in ein neues Röhrchen.
Beurteilen Sie mit einem Spektralphotometer die Menge der RNA in der Probe. Verwenden Sie einen Mikroliter Elutionslösung als Blindling und einen Mikroliter RNA-Lösung, die aus isolierten Follikeln extrahiert wurde. Überprüfen Sie, ob das Verhältnis 260/280 für die RNA-Reinheit bei etwa 2,0 liegt.
Lagern Sie die Probe bei minus 80 Grad Celsius oder retrotranskribieren Sie sie direkt, um eine RT-qPCR durchzuführen. Mit diesem Protokoll wurden die beiden homogenisierten Eierstockfragmente von 4x2x1 Millimetern von derselben Patientin verarbeitet, um die Follikel zu isolieren. Die RNA-Quantifizierung ergab, dass 4,8 Nanogramm pro Mikroliter Gesamt-RNA aus Follikeln mit einer Größe von weniger als 75 Mikrometern und einem Reinheitsverhältnis von 1,89 extrahiert wurden.
Aus den weniger als 200 Mikrometer großen Follikeln wurden 10,5 Nanogramm pro Mikroliter Gesamt-RNA mit einem Reinheitsgrad von 1,74 extrahiert. Die RNA-Integritätszahl (RIN) betrug 7,1 bzw. 7,9 in den Röhrchen eins und zwei, was die Qualität der RNA aus unseren Proben bestätigte. Nach Durchführung eines Standardzyklus auf einem Real-Time-PCR-System betrugen die Zyklusschwellenwerte (CT) 30,87 und 29,56 für HPRT, 33,5 und 31,77 für Kit-Liganden und 30,71 und 30,57 für GDF9.
Die enzymatische Verdauung des Gewebes ist ein kritischer Punkt. Der Experimentator muss die Follikelintegrität während der Reaktion kontinuierlich bewerten und sicherstellen, indem er sie bei Bedarf stoppt. Neben Genexpressionsanalysen werden isolierte Follikel verwendet, um experimentelle Systeme zur Erhaltung der Fruchtbarkeit von Krebspatienten zu entwickeln, wie z.B. Follikel-in-vitro-Kulturen oder künstliche Eierstöcke.
Die Isolationstechnik erforderte eine Lernkurve, um eine große Anzahl intakter Follikel zu gewinnen. Den Forschern wird empfohlen, sicherzustellen, dass das Gewebe vor der Verdauung gut zertrümmert ist.
