이 프로토콜은 이러한 생식 세포에 대한 유전자 발현 분석을 평가하기 위해 주변 기질 세포에서 난소 난포를 분리하는 효율적인 방법을 설명합니다. 제어된 효소 및 기계적 분리를 사용하는 이 기술은 무결성을 유지하면서 모낭을 회수할 수 있습니다. 이 프로토콜에 따라 연구원은 이러한 세포에서 특정 유전자 발현을 평가할 수 있습니다.
이 기술은 난소 기능에 영향을 미치는 질병과 관련된 또는 독성 물질에 노출된 후 난포에서 유전자 발현의 결핍을 추가로 이해하는 데 사용될 수 있습니다. 첫 번째 웰에 5 밀리리터의 동결 방지 용액을 첨가하고 다음 4 개의 웰에 동결 방지제 농도를 감소시키는 Leibovitz 15 배지 5 밀리리터를 첨가하여 6 웰 플레이트를 준비하기 시작합니다. 안전 규칙에 따라 액체 질소에서 난소 피질 조각이 들어있는 바이알을 제거하십시오.
실온 또는 실온에서 30초 후, 바이알을 이중 증류수에 2분 동안 담근다. 수직 후드 안에서, 내용물을 얼음 위에 놓인 6웰 플레이트의 첫 번째 웰로 옮기기 전에 난소 피질 단편 바이알을 부드럽게 교반하고 엽니다. 이어서, 제1 웰 내의 난소 피질 단편을 5밀리리터의 Leibovitz 15 배지에서 감소하는 농도의 동결방지제를 함유하는 6-웰 플레이트의 각 웰 내로 연속적으로 옮긴다.
각 배지의 조직을 5 분 동안 부드럽게 교반합니다. 난포 분리를 위해 해동된 난소 조직을 10밀리리터의 해부 배지, 밀리리터당 30마이크로그램의 페니실린 G 및 밀리리터당 50마이크로그램의 스트렙토마이신으로 채워진 2mm 격자 페트리 접시에 옮깁니다. 필요한 경우 메스로 조직 크기를 조정하십시오.
조직 슬라이서의 세 조각을 쌓고 두 블록 사이에 난소 조각을 놓습니다. 칼날을 사용하여 조각을 반으로 자르고 블록을 통해 밀어 0.5mm 두께의 두 조각을 얻습니다. 티슈 다지퍼를 사용하여 티슈를 잘라 더 작은 조각을 얻습니다.
필요한 경우 조직이 부서 질 때까지 메스로 나머지 조각을 수동으로 자릅니다. 조직이 부서지면 조각난 조직을 7 밀리리터의 소화 배지로 채워진 격자 모양의 페트리 접시에 옮기고 접시를 5 % 이산화탄소 및 섭씨 37 도의 인큐베이터에 넣습니다. 10 분마다 인큐베이터에서 페트리 접시를 가져 가십시오.
1밀리리터 피펫으로 소화 배지를 위아래로 피펫팅하여 조직을 세척합니다. 소화 배지에서 45분 동안 배양한 후 5배에서 6.3배의 배율 범위로 실체 현미경으로 접시를 놓고 마이크로 모세관 피펫을 사용하여 모낭을 회수합니다. 관심있는 모낭을 선택하고 입 피펫으로 빨아 들여 분리하십시오.
모낭이 피질 조각에 붙어 있으면 주사기 끝으로 피질을 뜯어내고 기질에서 모낭을 방출하여 두 개의 27게이지 주사기로 기계적으로 분리합니다. 마이크로 모세관을 사용하여, 분리된 모낭을 500 마이크로리터의 오일 배양물로 덮인 15 마이크로리터의 보정된 배양 배지를 함유하는 4-웰 플레이트로 옮긴다. 1 내지 10 개의 모낭을 옮긴 후, 500 마이크로 리터의 오일 배양 물로 덮인 PBS 15 마이크로 리터 2 방울로 각각 5 초 동안 2 회 헹굽니다.
구강 피펫을 사용하여 빈 튜브에 PBS가 최소화된 20개의 모낭을 수집하고 튜브를 얼음 위에 보관합니다. 소화 배지에서 90분 동안 배양한 후 저온 차단 용액을 첨가하여 효소 반응을 중지합니다. 화학 후드 아래에서 분리된 모낭을 RNA 추출 키트와 함께 제공된 용해 용액 100마이크로리터에 현탁합니다.
분리된 모낭을 분당 2500RPM으로 소용돌이쳐 구조를 파괴한 다음 50마이크로리터의 100% 에탄올을 튜브에 추가합니다. 그리고 튜브를 고속으로 잠깐 소용돌이칩니다. 볼텍싱 후, 튜브의 전체 부피를 컬럼 및 수집 튜브를 포함하는 마이크로 필터 카트리지 조립체로 옮긴다.
상기 조립체를 섭씨 4도에서 16, 363g에서 10초 동안 원심분리한다. 튜브를 10초 동안 원심분리하기 전에 키트와 함께 제공된 180마이크로리터의 세척 용액 1로 컬럼을 세척합니다. 180마이크로리터의 세척 용액 2, 3을 컬럼에 두 번 세척한 후 튜브를 마지막으로 한 번 원심분리하여 필터를 건조시키고 카트리지 아래에 새 수집 튜브를 놓습니다.
핵산의 용출을 수행하려면 먼저 8 마이크로 리터의 섭씨 75도 용출 용액을 필터 어셈블리에 첨가하십시오. 1분 후, 어셈블리를 30초 동안 원심분리한다. 7마이크로리터의 용출 용액으로 이 단계를 반복합니다.
완료되면 두 개의 국제 단위 DNase 및 DNase 버퍼를 튜브에 추가하고 섭씨 37도에서 20분 동안 튜브를 배양합니다. 실온에서 2분 동안 1 x 10 DNase 불활성화 시약으로 효소 활성을 차단한다. 다음으로, 튜브를 섭씨 4도에서 16, 363g에서 1.5분 동안 원심분리하고 RNA를 함유하는 현탁액을 새로운 튜브로 옮긴다.
분광 광도계를 사용하여 샘플의 RNA 양을 평가합니다. 블랭크로 1마이크로리터 용출 용액을 사용하고 분리된 모낭에서 추출한 RNA의 1마이크로리터 용액을 사용합니다. RNA 순도에 대해 260/280 비율이 약 2.0인지 확인하십시오.
그리고 샘플을 섭씨 영하 80도에 보관하거나 직접 역전사하여 RT-qPCR을 수행합니다. 이 프로토콜을 사용하여, 동일한 환자로부터 4x2x1 밀리미터의 균질화된 2개의 난소 단편을 처리하여 난포를 단리하였다. RNA 정량 분석에 따르면 총 RNA 마이크로리터당 4.8나노그램이 순도 비율 1.89로 크기가 75마이크로미터 미만인 모낭에서 추출되었습니다.
200 마이크로미터 미만의 난포로부터, 총 RNA의 마이크로리터당 10.5 나노그램을 1.74의 순도비로 추출하였다. RNA 무결성 번호 또는 RIN, 값은 튜브 1과 2에서 각각 7.1과 7.9로 샘플에서 RNA의 품질을 검증했습니다. Real-Time PCR 시스템에서 표준 사이클을 실행한 후 얻은 사이클 역치(CT)는 HPRT의 경우 30.87 및 29.56, 키트 리간드의 경우 33.5 및 31.77, GDF9의 경우 30.71 및 30.57이었습니다.
조직의 효소 소화는 중요한 포인트입니다. 실험자는 필요할 때 중지하여 반응 중에 모낭 무결성을 지속적으로 평가하고 보장해야 합니다. 유전자 발현 분석 외에도 분리된 난포는 시험관 내 난포 배양 또는 인공 난소와 같이 암 환자의 생식력을 보존하기 위한 실험 시스템을 개발하는 데 사용됩니다.
격리 기술에는 많은 수의 온전한 모낭을 회수하기 위한 학습 곡선이 필요했습니다. 연구자들은 소화 전에 조직이 잘 부서 졌는지 확인하는 것이 좋습니다.
