Este protocolo descreve um método eficiente para isolar folículos ovarianos das células do estroma circundante para avaliar análises de expressão gênica nessas células germinativas. Esta técnica, utilizando isolamentos enzimáticos e mecânicos controlados, permite a recuperação dos folículos mantendo sua integridade. Seguindo esse protocolo, o pesquisador pode avaliar expressões gênicas específicas dessas células.
A técnica poderia ser usada para entender melhor o déficit de expressão gênica nos folículos relacionado a doenças que afetam a função ovariana ou após exposição a agentes tóxicos. Comece a preparar uma placa de seis poços adicionando cinco mililitros de solução crioprotetora ao primeiro poço e cinco mililitros de meio Leibovitz 15 com concentrações decrescentes de crioprotetor aos próximos quatro poços. Remova um frasco para injetáveis contendo um fragmento cortical ovariano do azoto líquido, em conformidade com as regras de segurança.
Após 30 segundos à temperatura ambiente, ou RT, mergulhe o frasco para injetáveis em água bidestilada durante dois minutos. Dentro de um capuz vertical, agite suavemente e abra o frasco de fragmento cortical ovariano antes de transferir o conteúdo para o primeiro poço da placa de seis poços colocada no gelo. Em seguida, transferir o fragmento cortical ovariano no primeiro poço sucessivamente para cada poço da placa de seis poços contendo concentrações decrescentes de crioprotetor em cinco mililitros de meio Leibovitz 15.
Agite suavemente o tecido em cada meio durante cinco minutos. Para o isolamento dos folículos, transfira o tecido ovariano descongelado para uma placa de Petri quadriculada de dois milímetros preenchida com 10 mililitros de meio de dissecção, 30 microgramas por mililitro de penicilina G e 50 microgramas por mililitro de estreptomicina. Ajuste o tamanho do tecido com o bisturi, se necessário.
Empilhar os três pedaços do fatiador de tecido e colocar o fragmento ovariano entre os dois blocos. Corte o fragmento ao meio usando uma lâmina, deslizando através dos blocos para obter dois fragmentos de 0,5 milímetro de espessura. Corte o tecido usando o cortador de tecido para obter os pedaços menores.
Se necessário, corte as peças restantes manualmente com o bisturi até que o tecido seja esmagado. Uma vez que o tecido é esmagado, transfira o tecido fragmentado para uma placa de Petri quadriculada cheia com sete mililitros de meio de digestão antes de colocar a placa na incubadora a 5% de dióxido de carbono e 37 graus Celsius. Retire a placa de Petri da incubadora a cada 10 minutos.
Lave o tecido pipetando o meio de digestão para cima e para baixo com uma pipeta de um mililitro. Após 45 minutos de incubação no meio de digestão, colocar a placa sob um estereomicroscópio com amplitude de cinco a 6,3 vezes e recuperar os folículos usando uma pipeta microcapilar. Selecione os folículos de interesse e isole-os sugando-os com uma pipeta bucal.
Se os folículos permanecerem presos em um pedaço do córtex, isole-os mecanicamente com duas seringas de calibre 27, arrancando o córtex com a ponta das seringas e liberando folículos do estroma. Usando o microcapilar, transferir os folículos isolados para uma placa de quatro poços contendo 15 microlitros do meio de cultura calibrado coberto por 500 microlitros de cultura de óleo. Após transferir de um a 10 folículos, enxágue-os duas vezes em duas gotas de 15 microlitros de PBS cobertas com 500 microlitros de cultura de óleo por cinco segundos cada.
Usando a pipeta bucal, colete 20 folículos com PBS mínimo em um tubo vazio e mantenha o tubo no gelo. Após 90 minutos de incubação no meio de digestão, pare a reação enzimática adicionando uma solução de bloqueio a frio. Sob a capa química, suspender os folículos isolados em 100 microlitros da solução de lise fornecida com o Kit de Extração de RNA.
Vórtice os folículos isolados a 2500 RPM por minuto para quebrar sua estrutura e, em seguida, adicione 50 microlitros de etanol a 100% ao tubo. E brevemente vórtice o tubo em alta velocidade. Após o vórtice, transfira o volume total do tubo para um conjunto de cartuchos de microfiltro, composto por uma coluna e um tubo de coleta.
E centrifugar o conjunto por 10 segundos a 16, 363g a quatro graus Celsius. Lave a coluna com 180 microlitros da Solução de Lavagem 1 fornecida com o kit antes de centrifugar o tubo por 10 segundos. Depois de dar duas lavagens de 180 microlitros de Wash Solution 2, 3 à coluna, seque o filtro centrifugando o tubo uma última vez e coloque um novo tubo de coleta sob o cartucho.
Para realizar a eluição dos ácidos nucleicos, primeiro adicione oito microlitros de solução de eluição de 75 graus Celsius ao conjunto do filtro. Após um minuto, centrifugar o conjunto por 30 segundos. Repita este passo com sete microlitros de Solução de Eluição .
Uma vez feito, adicione duas unidades internacionais DNase e DNase tampão ao tubo e incube o tubo por 20 minutos a 37 graus Celsius. Bloquear a atividade enzimática com um por 10 reagente de inativação da DNase por dois minutos à temperatura ambiente. Em seguida, centrifugar o tubo por 1,5 minutos a 16, 363g a quatro graus Celsius e transferir a suspensão contendo o RNA para um novo tubo.
Usando um espectrofotômetro, avaliar a quantidade de RNA na amostra. Use uma solução de eluição de microlitro como um branco e uma solução de microlitro de RNA extraído de folículos isolados. Verifique se a relação 260/280 está em torno de 2,0 para a pureza do RNA.
E armazenar a amostra a menos 80 graus Celsius ou retrotranscrevê-la diretamente para realizar RT-qPCR. Utilizando esse protocolo, os dois fragmentos ovarianos homogeneizados de 4x2x1 milímetro da mesma paciente foram processados para isolar os folículos. A quantificação do RNA revelou que 4,8 nanogramas por microlitro de RNA total foram extraídos de folículos com menos de 75 micrômetros de tamanho com uma razão de pureza de 1,89.
Dos folículos de menos de 200 micrômetros, foram extraídos 10,5 nanogramas por microlitro de RNA total, com uma razão de pureza de 1,74. Os valores do número de integridade do RNA, ou NIR, foram 7,1 e 7,9 nos tubos um e dois, respectivamente, validando a qualidade do RNA de nossas amostras. Após a execução de um ciclo padrão em um sistema de PCR em tempo real, os limiares de ciclo, ou CT, obtidos foram 30,87 e 29,56 para HPRT, 33,5 e 31,77 para kit ligante e 30,71 e 30,57 para GDF9.
A digestão enzimática do tecido é um ponto crítico. O experimentador tem que avaliar continuamente e garantir a integridade do folículo durante a reação, interrompendo-a quando necessário. Além das análises de expressão gênica, folículos isolados são usados para desenvolver sistemas experimentais para preservar a fertilidade de pacientes com câncer, como cultura de folículos in vitro ou ovário artificial.
A técnica de isolamento exigiu uma curva de aprendizado para recuperar um grande número de folículos intactos. Os pesquisadores são aconselhados a garantir que o tecido esteja bem quebrado antes da digestão.
