يمكن تطبيق هذا البروتوكول بنجاح على حد سواء للحث على الاستجابة الالتهابية والليفية الهامة في كلتا الرئتين عن طريق حقن endotracheal من Bleomycin والتحقق من صحة العلاجات الجهازية المضادة للالتهابات والليفية الجديدة عن طريق حقن الوريد الذيل. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن الحقن المباشر للبلوميسين في القصبة الهوائية للماوس يضمن استهداف سريع للرئتين دون أي انسكاب في مجرى الهواء العلوي مما يسمح بالتحريض الآمن والقوي والقابل للتكرار من التهاب الرئة والتليف. وسوف يكون إثبات الإجراء الدكتور فيورنزا أورلاندو، طبيب بيطري من المختبر المتعاون لدينا.
للبدء، ضع الماوس المُجرّد على ظهره على منصة جراحية. إصلاح دقيق ساقيه مع شرائط الشريط الجراحية لعقد ذلك في مكان. لفرط تمديد عنق الماوس، ووضع الدعم مثل لفة القطن الأسنان تحت منطقة عنق الرحم.
ثم استخدم شفرة حلاقة لحلاقة الحلق بلطف. استخدام زوج من ملقط التشريحية لقرصة الجلد. استخدام زوج من حلقة التعامل مع مقص حاد منحني لجعل شق قصيرة حوالي نصف سنتيمتر في الطول في المراسلات إلى العضلات sternohyoid الماوس.
استخدام القطن الصوف العصي لوقف أي نزيف. ثم الخارجي القصبة الهوائية عن طريق تشريح حادة وتنظيف بلطف من الدهون والأنسجة الأخرى. تدوير منصة الجراحية لتوجيه الماوس مع رأسه نحو المشغل الذي يسمح للمشغل أثناء الحقن لزاوية حقنة بشكل صحيح.
لتصور القصبة الهوائية، ضع الماوس تحت مجهر التشغيل. ضبط الإضاءة وتعيين التكبير بين 1 و 1.2 ثم ضبط التركيز والحدة. يمكن تمييز القصبة الهوائية بسهولة على أنها أنبوب أبيض شفاف مع حلقات القصبة الهوائية المرئية بوضوح.
ماصة بلطف لخلط حل Bleomycin وpirate 100 ميكرولتر في حقنة 0.5 ملليلتر مع إبرة قياس 25 تجنب تشكيل فقاعة. مرة واحدة يتم تصور القصبة الهوائية بوضوح، ثقب بعناية مع طرف إبرة في زاوية 30 درجة. حقن ببطء 100 ميكرولترات من Bleomycin مباشرة في تجويف القصبة الهوائية.
بعد الانتظار بضع ثوان لوحدة التخزين بأكملها للسفر إلى أسفل الإبرة، إزالته من القصبة الهوائية. لاحظ بضع ثوان من انقطاع النفس الذي يحدث عندما يتم إدخال الإبرة بشكل صحيح في القصبة الهوائية مما يدل على أن كامل حجم السائل قد استنشق. التخلص بأمان من الحقنة والإبرة.
إغلاق اللفافة تحت الجلد والجرح الجلد مع خياطة 5-0 absorbable والسماح للحيوان لاسترداد. بعد تخدير الماوس مرة أخرى ومرة واحدة وقد تم تأكيد فقدان الوعي، ووضع الماوس تحت غطاء محرك السيارة العقيمة. استخدم قناع الوجه مع تدفق مستمر من 1.5٪ isoflurane للحفاظ على التخدير لطيف طوال التجربة.
لتعزيز توسع الأوعية والسماح للحقن أسهل، نقع الذيل في الماء الدافئ لمدة دقيقتين. مزيج تعليق من الحبل السري البشري الخلايا الوماضة mesenchymal بواسطة الأنابيب بلطف لتجنب تشكيل كتلة الخلية. استلهم 200 ميكرولترات في حقنة ملليلتر واحدة مع إبرة قياس 26 تجنب تشكيل فقاعة.
عقد الذيل من طرف وتصويب بلطف عليه. ثم حدد موقع الوريد الجانبي للذيل. كشط بلطف الذيل بمشرط ومسحه بنسبة 70٪ من الإيثانول.
بدءا من الجزء القعر من الذيل، أدخل الإبرة في الوريد بزاوية 15 درجة. ببطء غرس 200 ميكرولترات من الخلايا الحبل السري البشري mesenchymal. لمراقبة الحقن الوريدي الناجح ، لاحظ دخول السائل إلى الوريد دون مقاومة وعدم وجود الإسراف.
بعد الانتظار بضع ثوان حتى ينتقل حجم كامل أسفل الإبرة، إزالته من الوريد. ثم تطبيق الضغط لفترة وجيزة على الجرح دخول مع الشاش العقيم لمنع النزيف والسماح للحيوان للتعافي. التخلص بأمان من الحقنة والإبرة بعد التسريب.
بعد حقن Bleomycin ، تم تقييم التغيرات الهستوولوجية الرئوية من قبل هيماتوكسيلين وإوسين وPicrosirius Red التلطخ يؤكد التسلل الالتهابي والتليف الواسع النطاق مقارنة ببنية الرئة الطبيعية بعد الحقن الملحي. تم تخفيف التهاب الرئة والتليف الناجم عن بلوميسين إلى حد كبير عن طريق تسريب الخلايا السترومية السترومية السودية البشرية ولكن ليس عن طريق المالحة. تم قياس ترسب الكولاجين عن طريق مقايسة الهيدروكسي برولين.
بعد حقن بليوميسين، زادت مستويات الهيدروكسيل تدريجيا من اليوم الثامن إلى اليوم 14 و 21. في حين أن إضافة الحبل السري البشري الخلايا الومالية السحوقية قلّل بشكل كبير من آثار بلوميسين. مستويات التعبير من كول1A1 نوع واحد جين الكولاجين في الرئة بأكملها مرنا أظهرت أيضا زيادة تدريجية في أيام 8 و 14 و 21 التي تم تخفيضها جزئيا عن طريق علاج الحبل السري البشري مسينشيمال الخلية.
وأظهرت المناعة مع أجسام مضادة محددة أن غرست الخلايا السترومية الحبل السري البشري غرست بسرعة وفعالية وصلت إلى رئة الماوس، على الرغم من أنه تم الكشف عن عدد قليل من الخلايا فقط. وتشير هذه البيانات إلى حدوث تفكك سريع للخلايا من إصابة الموقع على الرغم من التأثير الوقائي المطول. استخدام مجهر التشغيل يضمن ثقة عالية من النجاح من خلال السماح للمشغل لرصد بدقة الموضع الصحيح للإبرة في القصبة الهوائية الماوس قبل التثبيت، وبالتالي تقليل خطر الإضرار به.
