O protocolo de dissociação do tecido pancreático demonstrado é simples e fornece uma ferramenta para isolar células únicas viáveis do tecido pancreático em diferentes estágios durante o processo de malignidade, incluindo tumores sólidos. A recuperação de células acinares intactas e viáveis é um grande desafio. O protocolo pode recuperar células únicas viáveis de pancreata normal, pancreata com lesões pré-malignas ou tumores pancreáticos contendo numerosas células estromais e imunes.
O uso deste protocolo para dissecar tumores pancreáticos humanos ou pâncreas inflamado poderia auxiliar na investigação dessas doenças para encontrar novos biomarcadores e tratamentos. O método é fácil de usar e pode fornecer os resultados desejados com o mínimo de prática. Este vídeo ajudará a visualizar os pequenos detalhes do protocolo.
Antes de iniciar a dissecção, mantenha todos os instrumentos e equipamentos prontos no gelo. Após a fixação do camundongo eutanasiado, borrife seu abdômen com etanol 70%. Usando tesoura e pinça, faça uma incisão em forma de V de 2,5 centímetros na área genital do animal e prossiga para cima para abrir totalmente a cavidade abdominal.
Localize o estômago no lado esquerdo do rato e o pâncreas, que fica perto do baço. Usando duas pinças, separe o pâncreas do estômago e duodeno sem rasgar. Continue e separe o pâncreas do intestino delgado, jejuno e íleo.
Mova o pâncreas para o lado direito e separe as conexões restantes entre o pâncreas e a cavidade torácica com pinças para desprender completamente o pâncreas e o baço fixado. Com cuidado, remova o pâncreas sem gordura mesentérica ou outro tecido adjacente e espalhe-o para exame em uma placa de Petri sobre gelo. Seguindo a composição mencionada no texto, prepare os tampões de dissociação 1 e 2, lave o tampão e a solução de parada de atividade enzimática com antecedência.
Coloque o pâncreas em um tubo de 50 mililitros sobre gelo e enxágue-o em soro bovino fetal a 10%, ou FBS, e Hank's Balanced Salt Solution, ou HBSS. A gordura vai flutuar e o pâncreas vai afundar. Esta é uma maneira fácil de visualizar e remover rapidamente o tecido adiposo branco contaminante ainda aderido ao pâncreas.
Em seguida, transfira e mantenha o tecido pancreático do camundongo em uma placa de Petri estéril contendo cinco mililitros de HBSS no gelo até o corte. Usando uma tesoura Noyes e um bisturi, corte o pâncreas em pequenos pedaços de um a três milímetros cúbicos. Depois de transferir os tecidos para um tubo de centrífuga, centrifuga-o a 350G e quatro graus Celsius por cinco minutos.
Aspirar e descartar o sobrenadante para remover fragmentos celulares e células sanguíneas. Ressuspender: suspender as peças em tampão de dissociação 1 contendo 0,02% de tripsina-C e 0,05%EDTA por 10 minutos a 37 graus Celsius com agitação. Lave imediatamente com 10%FBS e DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) e centrifugue por cinco minutos a 350G e quatro graus Celsius.
Lave novamente ressuspendendo o pellet em 10 mililitros de tampão de lavagem e centrifugando como anteriormente por cinco minutos antes da próxima etapa de dissociação. Incubar o pâncreas em tampão de dissociação 2 durante 15 minutos a 37 graus Celsius com agitação a 180 rotações por minuto. Após 15 minutos, realizar dissociação mecânica pipetando vigorosamente os fragmentos pancreáticos para cima e para baixo 10 vezes usando pipetas sorológicas estéreis.
Repita usando pipetas de tamanho decrescente, começando de 25, 10 a 5 mililitros. Incube a amostra para levá-la a 37 graus Celsius. Utilizar microscopia óptica para monitorar a dissociação de acordo com a quantidade de célula única na suspensão.
Monitorar a viabilidade celular usando azul de tripano. Continue a incubação e verifique a dissociação colhendo amostras a cada cinco minutos. Incubar até que 90% das células sejam separadas em células únicas.
Depois que o tecido pancreático estiver bem dissociado, indicado pelo desaparecimento dos fragmentos pancreáticos e pelo aumento da turbidez da solução, pare a reação enzimática lavando duas vezes com a solução de parada de atividade enzimática por cinco minutos a quatro graus Celsius. A partir desta etapa, mantenha a suspensão da célula no gelo. Passe a suspensão celular através de uma malha de nylon de 70 mícrons.
Uma malha de nylon menor pode reduzir a viabilidade celular. Verificar a viabilidade celular ao microscópio. Ressuspenda e lave o pellet com 5 a 10 mililitros de solução tamponada gelada antes de contar as células.
Se forem observados vários glóbulos vermelhos, trate as células com um tampão de lise de glóbulos vermelhos durante dois minutos à temperatura ambiente. Nos casos em que forem observados aglomerados, as amostras devem ser novamente tratadas com tripsina, conforme descrito anteriormente. Se a viabilidade for inferior a 80%, as células vivas devem ser isoladas usando a classificação de células ativadas por magnetismo ou o kit de remoção de células mortas MACS com colunas MACS MS.
A coloração vermelha do tecido pancreático isolado resultou da expressão de tdTomato nas células acinares. Em um estágio inicial da dissociação, havia baixo número de células isoladas e grande número de aglomerados. Posteriormente, células viáveis isoladas foram obtidas, evitando-se a redução do número de células viáveis.
O tempo de incubação mais prolongado reduziu a viabilidade das células. As células tdTomato positivas foram estimadas por meio de triagem celular ativada por fluorescência. O Protocolo de Dissociação Suave apoiou a recuperação de múltiplos tipos celulares, com alta viabilidade que permitiu o acompanhamento com a triagem celular dos tipos celulares desejados.
A contagem de células vivas para células mortas foi feita usando um hemacitômetro. As imagens de fluorescência dos cortes pancreáticos congelados mostraram células acinares positivas para tdTomato. O sequenciamento de RNA de célula única confirmou a detecção de todos os tipos celulares detectados na triagem celular ativada por fluorescência em cada tecido ressecado de todos os pontos de tempo.
A expressão da carboxipeptidase1, ou CPA1 em células acinares foi estudada, indicando mínima contaminação com o transcriptoma de outros tipos celulares. É importante notar que tempos de incubação mais longos reduziram a viabilidade das células, por isso é importante monitorar a amostra e observar a dissociação do tecido e a viabilidade celular a cada poucos minutos sob o microscópio. O protocolo de isolamento celular pode ser usado para sequenciamento de RNA de célula única, cultivo de células, ou como material de partida para organoides.
Essa técnica permite explorar como o câncer de pâncreas se desenvolve e investigar as interações entre as células que se infiltram no tecido inflamado ou canceroso.
