El protocolo de disociación del tejido pancreático demostrado es simple y proporciona una herramienta para aislar células individuales viables del tejido pancreático en diferentes etapas durante el proceso de malignidad, incluidos los tumores sólidos. La recuperación de células acinares intactas y viables es un reto importante. El protocolo puede recuperar células individuales viables de páncreas normal, páncreas con lesiones premalignas o tumores pancreáticos que contienen numerosas células estromales e inmunitarias.
El uso de este protocolo para diseccionar tumores de páncreas humanos o páncreas inflamado podría ayudar en la investigación de estas enfermedades para encontrar nuevos biomarcadores y tratamientos. El método es fácil de usar y puede proporcionar los resultados deseados con un mínimo de práctica. Este video ayudará a ver los pequeños detalles del protocolo.
Antes de comenzar la disección, mantenga todos los instrumentos y equipos listos en hielo. Después de fijar al ratón sacrificado, rocíe su abdomen con etanol al 70%. Con ayuda de unas tijeras y unas pinzas, haz una incisión en forma de V de 2,5 centímetros en la zona genital del animal, y procede hacia arriba para abrir completamente la cavidad abdominal.
Localiza el estómago en el lado izquierdo del ratón y el páncreas, que está cerca del bazo. Con dos fórceps, separe el páncreas del estómago y el duodeno sin desgarrarse. Continúe y separe el páncreas del intestino delgado, el yeyuno y el íleon.
Mueva el páncreas hacia el lado derecho y separe las conexiones restantes entre el páncreas y la cavidad torácica con fórceps para separar completamente el páncreas y el bazo adjunto. Con cuidado, retire el páncreas sin grasa mesentérica u otro tejido adyacente, y extiéndalo para examinarlo en una placa de Petri con hielo. Siguiendo la composición mencionada en el texto, prepare los tampones de disociación 1 y 2, el tampón de lavado y la solución de parada de actividad enzimática con anticipación.
Coloque el páncreas en un tubo de 50 mililitros sobre hielo y enjuáguelo con suero bovino fetal al 10%, o FBS, y solución salina equilibrada de Hank, o HBSS. La grasa flotará y el páncreas se hundirá. Esta es una manera fácil de visualizar y eliminar rápidamente el tejido adiposo blanco contaminante que aún está adherido al páncreas.
A continuación, transfiera y mantenga el tejido pancreático de ratón en una placa de Petri estéril que contenga cinco mililitros de HBSS en hielo hasta el corte. Con unas tijeras Noyes y un bisturí, corta el páncreas en trozos pequeños de uno a tres milímetros cúbicos. Después de transferir los tejidos a un tubo de centrífuga, centrifugue a 350 g y cuatro grados centígrados durante cinco minutos.
Aspire y deseche el sobrenadante para eliminar los fragmentos celulares y las células sanguíneas. Suspender, suspender las piezas en tampón de disociación 1 que contiene 0,02% de tripsina-C y 0,05% de EDTA durante 10 minutos a 37 grados centígrados con agitación. Lavar inmediatamente con FBS al 10% y Modified Eagle's Medium, o DMEM, de Dulbecco, y centrifugar durante cinco minutos a 350 g y cuatro grados centígrados.
Lavar de nuevo resuspendiendo el gránulo en 10 mililitros de tampón de lavado y centrifugando como antes durante cinco minutos antes del siguiente paso de disociación. Incubar el páncreas en el tampón de disociación 2 durante 15 minutos a 37 grados centígrados con agitación a 180 rotaciones por minuto. Después de 15 minutos, realice la disociación mecánica pipeteando vigorosamente los fragmentos pancreáticos hacia arriba y hacia abajo 10 veces con pipetas serológicas estériles.
Repita con pipetas de tamaño decreciente, a partir de 25, 10 y 5 mililitros. Incubar la muestra para llevarla a 37 grados centígrados. Utilice microscopía óptica para controlar la disociación de acuerdo con la cantidad de célula individual en la suspensión.
Monitorizar la viabilidad celular utilizando azul de tripano. Continúe la incubación y verifique la disociación tomando muestras cada cinco minutos. Incubar hasta que el 90% de las células se separen en células individuales.
Después de que el tejido pancreático esté bien disociado, indicado por la desaparición de fragmentos pancreáticos y el aumento de la turbidez de la solución, detenga la reacción enzimática lavando dos veces con la solución de parada de actividad enzimática durante cinco minutos a cuatro grados centígrados. A partir de este paso, mantenga la suspensión celular en hielo. Pasar la suspensión celular a través de una malla de nylon de 70 micras.
Un tamaño de malla de nailon más pequeño puede reducir la viabilidad de la célula. Comprobar la viabilidad celular bajo el microscopio. Vuelva a suspender y lave el gránulo con 5 a 10 mililitros de solución de lavado tamponada helada antes de contar las células.
Si se observan varios glóbulos rojos, trátelos con un tampón de lisis de glóbulos rojos durante dos minutos a temperatura ambiente. En los casos en que se observen grumos, las muestras deben ser tratadas de nuevo con tripsina, como se ha descrito anteriormente. Si la viabilidad es inferior al 80%, las células vivas deben aislarse utilizando la clasificación de células activadas magnéticamente o el kit de eliminación de células muertas MACS con columnas MACS MS.
El color rojo del tejido pancreático aislado fue el resultado de la expresión de tdTomato en las células acinares. En una etapa temprana de la disociación, había un bajo número de células aisladas y un gran número de grupos. Posteriormente, se obtuvieron células viables aisladas evitando reducir el número de células viables.
Una incubación más prolongada redujo la viabilidad de las células. Las células tdTomato positivas se estimaron mediante clasificación celular activada por fluorescencia. El protocolo de disociación suave apoyó la recuperación de múltiples tipos de células, con una alta viabilidad que permitió hacer un seguimiento con la clasificación celular de los tipos celulares deseados.
El recuento de células vivas a células muertas se realizó con un hemacitómetro. Las imágenes de fluorescencia de las secciones pancreáticas congeladas mostraron las células acinares positivas para tdTomato. La secuenciación de ARN de una sola célula confirmó la detección de todos los tipos de células detectados en la clasificación celular activada por fluorescencia en cada tejido resecado de todos los puntos temporales.
Se estudió la expresión de carboxipeptidasa1 o CPA1 en células acinares, lo que indica una contaminación mínima con el transcriptoma de otros tipos celulares. Es importante tener en cuenta que los tiempos de incubación más largos redujeron la viabilidad de las células, por lo que es importante monitorear la muestra y observar la disociación del tejido y la viabilidad celular cada pocos minutos bajo el microscopio. El protocolo de aislamiento celular se puede utilizar para la secuenciación de ARN de una sola célula, el cultivo de células o como material de partida para organoides.
Esta técnica permite explorar cómo se desarrolla el cáncer de páncreas e investigar las interacciones entre las células que se infiltran en el tejido inflamado o canceroso.
