Le protocole de dissociation du tissu pancréatique démontré est simple et fournit un outil pour isoler des cellules uniques viables du tissu pancréatique à différents stades du processus de malignité, y compris les tumeurs solides. Récupérer des cellules acineuses intactes et viables est un défi majeur. Le protocole permet de récupérer des cellules uniques viables d’un pancréas normal, d’un pancréas présentant des lésions précancéreuses ou de tumeurs pancréatiques contenant de nombreuses cellules stromales et immunitaires.
L’utilisation de ce protocole pour disséquer des tumeurs pancréatiques humaines ou des pancréas enflammés pourrait aider à étudier ces maladies pour trouver de nouveaux biomarqueurs et traitements. La méthode est facile à utiliser et peut fournir les résultats souhaités avec un minimum de pratique. Cette vidéo vous aidera à voir les petits détails du protocole.
Avant de commencer la dissection, gardez tous les instruments et l’équipement prêts sur la glace. Après avoir réparé la souris euthanasiée, vaporisez son abdomen avec 70% d’éthanol. À l’aide de ciseaux et de pinces, faites une incision en forme de V de 2,5 centimètres dans la région génitale de l’animal et remontez pour ouvrir complètement la cavité abdominale.
Localisez l’estomac sur le côté gauche de la souris et le pancréas, qui se trouve près de la rate. À l’aide de deux pinces, séparez le pancréas de l’estomac et du duodénum sans déchirer. Continuez et séparez le pancréas de l’intestin grêle, du jéjunum et de l’iléon.
Déplacez le pancréas vers la droite et séparez les connexions restantes entre le pancréas et la cavité thoracique avec des pinces pour détacher complètement le pancréas et la rate attachée. Retirez soigneusement le pancréas sans graisse mésentérique ni autre tissu adjacent, et étalez-le pour examen dans une boîte de Pétri sur glace. En suivant la composition mentionnée dans le texte, préparez à l’avance les tampons de dissociation 1 et 2, lavez le tampon et la solution d’arrêt de l’activité enzymatique.
Placez le pancréas dans un tube de 50 millilitres sur de la glace et rincez-le dans du sérum de veau fœtal à 10 %, ou FBS, et de la solution saline équilibrée de Hank, ou HBSS. La graisse flottera et le pancréas coulera. Il s’agit d’un moyen facile de visualiser et d’éliminer rapidement le tissu adipeux blanc contaminant encore attaché au pancréas.
Ensuite, transférez et conservez le tissu pancréatique de la souris dans une boîte de Pétri stérile contenant cinq millilitres de HBSS sur glace jusqu’à la coupe. À l’aide de ciseaux Noyes et d’un scalpel, coupez le pancréas en petits morceaux d’un à trois millimètres cubes. Après avoir transféré les tissus dans un tube à centrifuger, centrifugez-les à 350 g et à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes.
Aspirer et jeter le surnageant pour éliminer les fragments cellulaires et les cellules sanguines. Suspendre à nouveau les morceaux dans le tampon de dissociation 1 contenant 0,02 % de trypsine-C et 0,05 % d’EDTA pendant 10 minutes à 37 degrés Celsius avec agitation. Laver immédiatement avec 10 % FBS et Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium, ou DMEM, et centrifuger pendant cinq minutes à 350 G et quatre degrés Celsius.
Lavez à nouveau en remettant le granulé en suspension dans 10 millilitres de tampon de lavage et en centrifugeant comme précédemment pendant cinq minutes avant la prochaine étape de dissociation. Incuber le pancréas dans le tampon de dissociation 2 pendant 15 minutes à 37 degrés Celsius avec agitation à 180 rotations par minute. Après 15 minutes, effectuez une dissociation mécanique en pipetant vigoureusement les fragments pancréatiques de haut en bas 10 fois à l’aide de pipettes sérologiques stériles.
Répétez l’opération en utilisant des pipettes de taille décroissante, en commençant par 25, 10 à 5 millilitres. Incubez l’échantillon pour l’amener à 37 degrés Celsius. Utilisez la microscopie optique pour surveiller la dissociation en fonction de la quantité de cellule unique dans la suspension.
Surveillez la viabilité cellulaire à l’aide de bleu de trypan. Poursuivre l’incubation et vérifier la dissociation en prélevant des échantillons toutes les cinq minutes. Incuber jusqu’à ce que 90% des cellules soient séparées en cellules simples.
Une fois que le tissu pancréatique est bien dissocié, indiqué par la disparition des fragments pancréatiques et l’augmentation de la turbidité de la solution, arrêtez la réaction enzymatique en lavant deux fois avec une solution d’arrêt de l’activité enzymatique pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. À partir de cette étape, maintenez la suspension cellulaire sur la glace. Passez la suspension cellulaire à travers un maillage en nylon de 70 microns.
Une taille de maille de nylon plus petite peut réduire la viabilité des cellules. Vérifier la viabilité cellulaire au microscope. Remettez en suspension et lavez la pastille avec 5 à 10 millilitres de solution de lavage tamponnée glacée avant de compter les cellules.
Si plusieurs globules rouges sont observés, traitez les cellules avec un tampon de lyse des globules rouges pendant deux minutes à température ambiante. Dans les cas où des amas sont observés, les échantillons doivent être traités à nouveau avec de la trypsine, comme décrit précédemment. Si la viabilité est inférieure à 80 %, les cellules vivantes doivent être isolées à l’aide du tri des cellules activées par magnétisme ou du kit d’élimination des cellules mortes MACS avec colonnes MACS MS.
La couleur rouge du tissu pancréatique isolé résulte de l’expression de tdTomato dans les cellules acineuses. À un stade précoce de la dissociation, il y avait un faible nombre de cellules isolées et un grand nombre d’amas. Plus tard, des cellules viables isolées ont été obtenues tout en évitant de réduire le nombre de cellules viables.
Une incubation plus longue réduisait la viabilité des cellules. Les cellules positives à tdTomato ont été estimées à l’aide d’un tri cellulaire activé par fluorescence. Le protocole de dissociation douce a permis la récupération de plusieurs types de cellules, avec une viabilité élevée qui a permis de suivre le tri cellulaire des types de cellules souhaités.
Le comptage des cellules vivantes aux cellules mortes a été effectué à l’aide d’un hémacytomètre. Les images de fluorescence de coupes pancréatiques congelées ont montré les cellules acineuses positives de tdTomato. Le séquençage de l’ARN d’une cellule unique a confirmé la détection de tous les types de cellules détectés lors du tri cellulaire activé par fluorescence dans chaque tissu réséqué à tous les points temporels.
L’expression de la carboxypeptidase1, ou CPA1 dans les cellules acineuses, a été étudiée, indiquant une contamination minimale par le transcriptome d’autres types de cellules. Il est important de noter que des temps d’incubation plus longs ont réduit la viabilité des cellules, il est donc important de surveiller l’échantillon et d’observer la dissociation du tissu et la viabilité cellulaire toutes les quelques minutes au microscope. Le protocole d’isolement cellulaire peut être utilisé pour le séquençage de l’ARN d’une seule cellule, la culture de cellules ou comme matériau de départ pour les organoïdes.
Cette technique permet d’explorer comment le cancer du pancréas se développe et d’étudier les interactions entre les cellules qui s’infiltrent dans les tissus enflammés ou cancéreux.
