입증된 췌장 조직 해리 프로토콜은 간단하며 고형 종양을 포함하여 악성 종양 과정 중 여러 단계에서 췌장 조직에서 생존 가능한 단일 세포를 분리하는 도구를 제공합니다. 온전하고 생존 가능한 아시나 세포를 복구하는 것은 중요한 과제입니다. 이 프로토콜은 정상 췌장, 전악성 병변이 있는 췌장 또는 수많은 기질 및 면역 세포를 포함하는 췌장 종양에서 생존 가능한 단일 세포를 복구할 수 있습니다.
인간의 췌장 종양이나 염증이 있는 췌장을 해부하기 위해 이 프로토콜을 사용하면 이러한 질병을 조사하여 새로운 바이오마커 및 치료법을 찾는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 방법은 사용하기 쉽고 최소한의 연습으로 원하는 결과를 제공할 수 있습니다. 이 비디오는 프로토콜의 작은 세부 사항을 보는 데 도움이 될 것입니다.
해부를 시작하기 전에 모든 기구와 장비를 얼음 위에 준비하십시오. 안락사된 쥐를 고정한 후 복부에 70% 에탄올을 뿌립니다. 가위와 집게를 사용하여 동물의 생식기 부위를 2.5cm의 V자 모양으로 절개하고 위쪽으로 진행하여 복강을 완전히 엽니다.
쥐의 왼쪽에 있는 위와 비장 근처에 있는 췌장을 찾습니다. 두 개의 겸자를 사용하여 찢어지지 않고 위와 십이지장에서 췌장을 분리합니다. 계속해서 췌장을 소장, jejunum 및 회장에서 분리합니다.
췌장을 오른쪽으로 옮기고 췌장과 흉강 사이의 나머지 연결부를 겸자로 분리하여 췌장과 부착된 비장을 완전히 분리합니다. 장간막 지방이나 다른 인접 조직이 없는 췌장을 조심스럽게 제거하고 얼음 위의 페트리 접시에 펼쳐 검사를 합니다. 본문에 언급된 조성물에 따라, 해리 완충액 1, 2를 준비하고, 완충액과 효소 활성 정지 용액을 미리 세척한다.
췌장을 얼음 위에 놓인 50밀리리터 튜브에 넣고 10% 소 태아 혈청(FBS)과 행크스 밸런스 솔트 솔루션(HBSS)으로 헹굽니다. 지방은 뜨고 췌장은 가라앉습니다. 이것은 췌장에 여전히 붙어 있는 오염된 백색 지방 조직을 시각화하고 신속하게 제거하는 쉬운 방법입니다.
다음으로, 마우스 췌장 조직을 절단할 때까지 얼음에 5ml의 HBSS가 포함된 멸균 페트리 접시에 옮겨 보관합니다. Noyes 가위와 메스를 사용하여 췌장을 1-3 입방 밀리미터의 작은 조각으로 자릅니다. 조직을 원심분리 튜브에 옮긴 후 350G, 섭씨 4도에서 5분 동안 원심분리합니다.
상층액을 흡인하고 폐기하여 세포 조각과 혈액 세포를 제거합니다. 섭씨 1도에서 10분 동안 0.02%trypsin-C 및 0.05%EDTA를 포함하는 해리 완충액에 조각을 재현탁하여 교반합니다. 즉시 10% FBS와 Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM)으로 세척하고 섭씨 350G에서 5분 동안 원심분리합니다.
펠릿을 10밀리리터의 세척 완충액에 다시 현탁시키고 다음 해리 단계 전에 이전과 같이 5분 동안 원심분리하여 다시 세척합니다. 섭씨 37도에서 분당 180회 회전으로 교반하면서 해리 완충액 2에서 15분 동안 췌장을 배양합니다. 15분 후 멸균 혈청학적 피펫을 사용하여 췌장 조각을 위아래로 10회 세게 피펫팅하여 기계적 해리를 수행합니다.
크기가 줄어드는 피펫을 사용하여 25, 10에서 5밀리리터까지 반복합니다. 샘플을 배양하여 섭씨 37도까지 가져옵니다. 광학 현미경을 사용하여 현탁액의 단일 셀의 양에 따른 해리를 모니터링합니다.
trypan blue를 사용하여 세포 생존율을 모니터링합니다. 배양을 계속하고 5분마다 샘플을 채취하여 해리를 확인합니다. 세포의 90%가 단일 세포로 분리될 때까지 배양합니다.
췌장 조직이 잘 해리된 후 췌장 조각이 사라지고 용액의 탁도가 증가하는 것으로 표시되며 섭씨 4도에서 효소 활성 정지 용액으로 5분 동안 두 번 세척하여 효소 반응을 중지합니다. 이 단계에서 셀 서스펜션을 얼음 위에 유지하십시오. 셀 현탁액을 70미크론 나일론 메쉬에 통과시킵니다.
나일론 메쉬 크기가 작을수록 세포 생존율이 감소할 수 있습니다. 현미경으로 세포 생존율을 확인하십시오. 세포를 계수하기 전에 5-10 밀리리터의 얼음처럼 차가운 완충 세척액으로 펠릿을 재현탁하고 세척하십시오.
여러 적혈구가 관찰되면 적혈구 용해 완충액으로 실온에서 2분 동안 치료합니다. 덩어리가 관찰되는 경우 앞에서 설명한 대로 샘플을 트립신으로 다시 처리해야 합니다. 생존율이 80% 미만인 경우 자기 활성화 세포 분류 또는 MACS MS 컬럼이 포함된 MACS 죽은 세포 제거 키트를 사용하여 살아있는 세포를 분리해야 합니다.
분리된 췌장 조직의 붉은 색은 아시나 세포에서 tdTomato의 발현으로 인한 것입니다. 해리의 초기 단계에서, 고립된 세포의 수가 적고 덩어리의 수가 많았습니다. 나중에, 생존 가능한 세포의 수를 줄이지 않으면서 분리된 생존 가능한 세포를 얻었다.
배양이 길어지면 세포의 생존력이 감소했습니다. tdTomato 양성 세포는 형광 활성화 세포 분류를 사용하여 추정되었습니다. Gentle Dissociation Protocol은 원하는 세포 유형의 세포 분류를 추적할 수 있는 높은 생존력으로 여러 세포 유형의 회수를 지원했습니다.
살아있는 세포에서 죽은 세포까지의 계수는 혈구계를 사용하여 수행되었습니다. 얼어붙은 췌장 절편의 형광 이미지는 tdTomato 양성 아시나 세포를 보여주었습니다. 단일 세포 RNA 염기서열 분석은 모든 시점에서 절제된 각 조직의 형광 활성화 세포 분류에서 검출된 모든 세포 유형의 검출을 확인했습니다.
아시나 세포에서 카르복시펩티다아제1 또는 CPA1 발현을 연구하여 다른 세포 유형의 전사체에 대한 오염을 최소화했습니다. 배양 시간이 길어지면 세포의 생존력이 감소하므로 샘플을 모니터링하고 현미경으로 몇 분마다 조직의 해리와 세포 생존력을 관찰하는 것이 중요합니다. 세포 분리 프로토콜은 단일 세포 RNA 염기서열분석, 세포 배양 또는 오가노이드의 출발 물질로 사용할 수 있습니다.
이 기술을 통해 췌장암이 어떻게 발생하는지 탐구하고 염증 또는 암 조직에 침투하는 세포 간의 상호 작용을 조사할 수 있습니다.
