يصف هذا البروتوكول طريقة لقياس التحكم الميكانيكي في الاسترخاء أو الاعتماد على الإجهاد لانبساط العضلات في الترابيق القلبي. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تركز على استرخاء القلب. نظرا لعدم وجود خيارات علاجية للأمراض الانبساطية ، يمكن استخدام هذه التقنية لتحديد مؤشرات جديدة وأهداف دوائية تتعلق باسترخاء القلب.
سيتم عرض هذه الطريقة بقلب القوارض ، ولكن يمكن استخدامها على أي عضلة سليمة. سيكون إثبات هذا الإجراء أنا وأنيتا آبو ، مساعد أبحاث جامعي في مختبري. للبدء ، قم بإزالة قلب نموذج الحيوان الصغير الذي تم تشريحه من القنية وضعه في طبق وزن مطلي بالمطاط الصناعي السيليكوني للتحضير للعزل التربيقي.
ثم ضع القلب وأضيئه تحت مجهر ستيريو. بعد تحديد موقع مجرى تدفق البطين الأيمن ، قم بتثبيت الأذين الأيسر وقمة البطين بالمطاط الصناعي السيليكوني في الطبق. باستخدام مقص Vannas الطويل ، يتم قطعه من مجرى تدفق البطين الأيمن إلى القمة على طول الحاجز.
بعد ذلك ، قطع من مجرى تدفق البطين الأيمن إلى الأذين الأيمن بالقرب من الشريان الأورطي ، ثم قطع من خلال الأذين الأيمن. باستخدام الملقط ، اسحب بعناية الجدار الحر للبطين الأيمن من مجرى التدفق دون تمديد الأنسجة. يمكن قطع خيوط النسيج الضام البيضاء الرقيقة ، إذا وجدت ، ولكن ليس خيوط الأنسجة الوردية الأكبر ، لأنها قد تكون ترابيق.
ثبت الجدار الحر لمثلث البطين الأيمن بالطبق لكشف البطين الأيمن. باستخدام ماصة زجاجية ذائبة رفيعة ذات نهاية حادة ، ابحث في الشغاف المكشوف عن الترابيق القائم بذاته دون الضغط. تجنب العضلات الحليمية المثلثة وحدد الترابيق ذي الجوانب المتوازية ، والتي غالبا ما توجد بالقرب من قاعدة جدار البطين الأيمن الحر وعلى طول الحاجز.
تشريح الترابيقولا باستخدام مقص فانا صغير ، وترك قطعة مكعبة من الأنسجة في كل طرف من طرفي الترابيقولا للسماح بالتعلق. بعد ذلك ، قم بقطع ما يقرب من بوصتين من نهاية ماصة نقل سعة سبعة ملليلتر ، واسحب الترابيكولا ببطء إلى الماصة ، وانقلها إلى طبق وزن جديد ، يحتوي على محلول تروية بنسبة 50٪ ومحلول تيرود معدل بنسبة 50٪. اسمح للعضلة بالتوازن مع الزيادة في الكالسيوم خارج الخلية داخل المحلول المختلط لعدة دقائق.
قم بإيقاف تشغيل المضخة التي تزود غرفة التجارب بضخ أو شفط فائق. باستخدام ماصة نقل التجويف الكبيرة ، انقل الترابيق إلى غرفة التجارب المليئة بمحلول Tyrode. قم بتثبيت قطعة مكعبة واحدة من الأنسجة في نهاية الترابيقولا بخطاف على محول الطاقة ، ثم قم بتثبيت المكعب الثاني بالمحرك.
أعد تشغيل الضخ الفائق وابدأ في تنظيم العضلات لتحديد جهد العتبة. السرعة عند 20٪ فوق عتبة الجهد لمدة ساعة واحدة تقريبا. في نهاية فترة التوازن هذه ، قم بتمديد العضلات ببطء باستخدام الميكرومتر المتصل بالمحرك ، حتى يتم تحقيق توليد الإجهاد الأمثل من خلال مراقبة التوتر المتطور.
توقف عن زيادة طول العضلات عندما يرتفع التوتر الانبساطي السلبي بشكل أسرع من ذروة التوتر ، مما يشير إلى أن الطول الأمثل قد تم تجاوزه. قم بإيقاف تشغيل إضاءة المجهر المرسلة وإضاءة الترابيق باستخدام إضاءة معقوفة بزاوية شديدة الانحدار. باستخدام كاميرا تمت معايرتها مسبقا متصلة من خلال بصريات المجهر ، التقط صورة للترابيكولا أثناء الانبساط في المجلد التجريبي.
متوسط قياس القطر وتحويل القطر والطول من بكسل إلى ملليمترات باستخدام معايرة تم الحصول عليها مسبقا. احسب مساحة المقطع العرضي وطول العضلات بالميكرومتر. في برنامج الحصول على البيانات ، احصل على بيانات مثبتة بالتحميل عن طريق تحديد التحميل اللاحق في ملف dap ، وكرر قيم معلمات الكسب والتكامل النسبي عن طريق حفظ الملف في محرر النصوص ، ثم اضغط على Run Experiment "في الواجهة.
تحكم في نهاية مشبك الحمل عن طريق تغيير الوضع. كرر الاستحواذ أثناء تغيير نهاية مشبك الحمل من الصفر إلى الاكتمال ، وإعادة الإطالة مرة أخرى إلى طول البداية. لزيادة الطول ، قم بزيادة عتبة إنهاء مشبك الحمل بشكل تدريجي من الصفر حتى تعاد العضلة تقريبا إلى طولها الأصلي.
إذا رغبت في ذلك ، قم بتعديل التحميل اللاحق وكرر الاستحواذ على الفور. إذا رغبت في ذلك ، قم بتعديل التحميل المسبق عن طريق تمديد العضلات أو تقصيرها ، أو عالج العضلات عن طريق إضافة مركبات إلى محلول Tyrode ، ولكن انتظر ما لا يقل عن 20 دقيقة للتأكد من استقرار استجابة القوة البطيئة ولكي يخترق المركب العضلات بالكامل. بمجرد اكتمال الحصول على البيانات ، قم بإزالة الترابيق وتنظيف النظام التجريبي.
قم بقياس الاسترخاء من خلال التأكد من أن برنامج تحليل البيانات يحلل النبض المثبت ، وأن البرنامج يكتسب بشكل صحيح بداية مشبك الحمل. بعد تحديد جميع آثار حالة معينة ، ارسم العلاقة بين معدل الاسترخاء ومعدل الإجهاد ، مما يحد من الحد الأقصى للبيانات إلى معدل إجهاد فسيولوجي أقل من واحد في الثانية. استبعد البيانات بمعدلات إجهاد منخفضة ، لأن مرحلة الانحلال قد لا تعكس الاضمحلال الأسي.
احصل على ميل الخط الفاصل بين معدل الانحلال ومعدل الانحدار ، وسجل الميل كمؤشر للتحكم الميكانيكي في الاسترخاء. تظهر هنا ترابيق قلبية واحدة مضاءة باستخدام ضوء LED معقوفة بزاوية شديدة الانحدار مقدارها ٧٥ درجة من محور عدسة المجهر. أظهرت منحنيات وقت الإجهاد ووقت الإجهاد لنفس الترابيقولا نشل متساوي القياس وثلاث تشنجات مشبك الحمل بمعدلات إجهاد متزايدة وانقباضي.
يتم حساب معدل الإجهاد من مشتق السلالة قبل الانحلال متساوي القياس مباشرة. يتم رسم البيانات على الرسم البياني لمعدل الاسترخاء مقابل معدل الإجهاد ، حيث يوفر ميل الخط التحكم الميكانيكي في الاسترخاء ، أو مؤشر MCR. أصعب عنصر في هذا البروتوكول هو عزل دقيق للترابيق القلبي.
يمكن دمج هذا البروتوكول مع قياسات أخرى للعضلات ، بما في ذلك الكالسيوم داخل الخلايا ، والانقباض ، وطول القطعة العضلية. أيضا ، يتم استخدام هذه الطريقة لتحديد الآليات الجزيئية وفهم أفضل للفيزيولوجيا المرضية لضعف استرخاء القلب.
