Этот протокол описывает метод измерения механического контроля релаксации или деформационной зависимости мышечной релаксации в сердечной трабекеле. Основное преимущество этой техники заключается в том, что она фокусируется на расслаблении сердца. Учитывая отсутствие вариантов лечения диастолических заболеваний, этот метод может быть использован для выявления новых индексов и мишеней лекарств, связанных с сердечной релаксацией.
Этот способ будет показан при сердце грызуна, но его можно использовать и на любой неповрежденной мышце. Продемонстрировать эту процедуру буду я и Анита Аббо, младший научный сотрудник в моей лаборатории. Для начала извлеките сердце грубой рассеченной модели мелкого животного из канюли и поместите его в весовую чашку с силиконовым эластомерным покрытием, чтобы подготовиться к трабекулярной изоляции.
Затем поместите и осветите сердце под стереомикроскопом. Найдя выходной тракт правого желудочка, прикрепите левое предсердие и верхушку желудочка к силиконовому эластомуру в чашке. С помощью длинных ножниц Vannas, разрежьте от правого желудочкового оттока до верхушки вдоль перегородки.
Далее разрезают выходной тракт правого желудочка до правого предсердия возле аорты, а затем разрезают правое предсердие. С помощью щипцов осторожно оттяните правую желудочковую свободную стенку из выходного тракта, не растягивая ткани. Белые тонкие соединительнотканные нити, если они обнаружены, могут быть разрезаны, но не более крупные розовые нити ткани, так как они могут быть трабекулами.
Приколите свободную стенку треугольника правого желудочка к тарелке, чтобы обнажить правый желудочек. Используя тонкую пипетку из расплавленного стекла с тупым концом, обыщите открытый эндокард на наличие отдельно стоящих трабекул, не применяя давления. Избегайте треугольных папиллярных мышц и выбирайте трабекулы с параллельными сторонами, которые часто встречаются у основания свободной стенки правого желудочка и вдоль перегородки.
Рассеките трабекулу с помощью маленьких ножниц Ваннаса, оставляя кусок ткани размером в один миллиметр на каждом конце трабекулы, чтобы его можно было прикрепить. Затем отрежьте примерно два дюйма от конца семимиллилитровой пипетки для переноса, медленно втяните трабекулу в пипетку и перенесите ее в новую чашу для взвешивания, содержащую 50% перфузионного раствора и 50% модифицированного раствора Тирода. Дайте мышце уравновеситься к увеличению внеклеточного кальция в смешанном растворе в течение нескольких минут.
Выключите насос, подающий суперфузию или всасывание в экспериментальную камеру. Используя пипетку для переноса большого диаметра, переместите трабекулу в экспериментальную камеру, заполненную раствором Тирода. Прикрепите один кубик ткани на конце трабекулы к крючку на преобразователе силы, затем прикрепите второй кубик к двигателю.
Перезапустите суперфузию и начните расхаживать мышцы, чтобы определить пороговое напряжение. Темп на 20% выше порогового напряжения в течение примерно одного часа. В конце этого периода равновесия медленно растягивайте мышцу с помощью микрометра, подключенного к двигателю, до тех пор, пока не будет достигнута оптимальная развитая генерация напряжения путем наблюдения за развитым напряжением.
Прекратите увеличивать длину мышц, когда пассивное диастолическое напряжение растет быстрее, чем пиковое напряжение, что указывает на то, что оптимальная длина пройдена. Выключите подсветку проходящего микроскопа и осветите трабекулу с помощью осветителя на гусиной шее под крутым углом. Используя предварительно откалиброванную камеру, подключенную через оптику микроскопа, запишите изображение трабекулы во время диастолы в экспериментальную папку.
Усредните меры диаметра и преобразуйте диаметр и длину из пикселей в миллиметры, используя ранее полученную калибровку. Рассчитайте площадь поперечного сечения и длину мышцы в микрометрах. В программном обеспечении для сбора данных получите зажатые данные загрузки, определив посленагрузку в файле dap, и выполните итерацию значений пропорционального усиления и параметров интегрирования, сохранив файл в текстовом редакторе, затем нажмите «Запустить эксперимент»в интерфейсе.
Управляйте концом зажима нагрузки, изменяя режим. Повторите захват, изменяя конец зажима нагрузки с нуля на полный, возвращаясь к начальной длине. Чтобы увеличить длину, постепенно увеличивайте порог окончания зажима нагрузки с нуля до тех пор, пока мышца почти не вернется к своей первоначальной длине.
При желании измените постнагрузку и немедленно повторите захват. При желании измените преднатяг, растянув или укоротив мышцу, или обработайте мышцу, добавив соединения в раствор Tyrode, но подождите не менее 20 минут, чтобы убедиться, что медленная силовая реакция стабилизировалась и соединение полностью проникло в мышцу. После завершения сбора данных удалите трабекулу и очистите экспериментальную систему.
Количественно оцените релаксацию, убедившись, что программа анализа данных анализирует зажатый удар и что программа правильно получает начало зажима нагрузки. После количественной оценки всех следов данного состояния постройте график взаимосвязи между скоростью релаксации и скоростью деформации, ограничив максимальные данные физиологической скоростью деформации менее одного в секунду. Исключите данные при низких скоростях деформации, так как фаза релаксации может не отражать экспоненциальный распад.
Получите наклон линии между скоростью релаксации и скоростью деформации и запишите наклон как показатель механического управления релаксацией. Здесь показана одиночная сердечная трабекула, освещенная светодиодной лампой на гусиной шее под крутым углом 75 градусов от оси линзы микроскопа. Кривые времени напряжения и времени деформации для одной и той же трабекулы показали изометрическое подергивание и три подергивания зажима нагрузки при возрастающей и систолической скорости деформации.
Скорость деформации рассчитывается из производной деформации непосредственно перед изометрической релаксацией. Данные нанесены на график зависимости скорости релаксации от скорости деформации, где наклон линии обеспечивает механический контроль релаксации, или индекс MCR. Самым сложным компонентом в этом протоколе является тщательная изоляция сердечной трабекулы.
Этот протокол можно комбинировать с другими измерениями мышц, включая внутриклеточный кальций, сократительную способность и длину саркомера. Также этот метод используется для выявления молекулярных механизмов и лучшего понимания патофизиологии нарушения сердечной релаксации.
