Bu protokol, kardiyak trabekülde gevşemenin mekanik kontrolünü veya kas gevşemesinin gerilme bağımlılığını ölçmek için bir yöntem tanımlar. Bu tekniğin en büyük avantajı, kardiyak gevşemeye odaklanmasıdır. Diyastolik hastalıklar için tedavi seçeneklerinin eksikliği göz önüne alındığında, bu teknik kardiyak gevşeme ile ilgili yeni indeksleri ve ilaç hedeflerini tanımlamak için kullanılabilir.
Bu yöntem bir kemirgen kalbi ile gösterilecektir, ancak herhangi bir sağlam kas üzerinde kullanılabilir. Bu prosedürü gösteren ben ve laboratuvarımda lisans araştırma görevlisi olan Anita Abbo olacak. Başlamak için, brüt disseke edilmiş küçük hayvan modelinin kalbini kanülden çıkarın ve trabeküler izolasyona hazırlanmak için silikon elastomer kaplı bir tartım kabına yerleştirin.
Sonra kalbi stereo mikroskop altına yerleştirin ve aydınlatın. Sağ ventrikül çıkış yolunu bulduktan sonra, sol atriyumu ve ventrikül tepesini çanaktaki silikon elastomere sabitleyin. Uzun Vannas makası kullanarak, sağ ventrikül çıkış yolundan septum boyunca tepeye kadar kesin.
Daha sonra, sağ ventrikül çıkış yolundan aortun yakınındaki sağ atriyuma kesin ve ardından sağ atriyumu kesin. Forseps kullanarak, sağ ventrikül serbest duvarını dokuyu germeden çıkış yolundan dikkatlice çekin. Beyaz ince bağ dokusu iplikçikleri, bulunursa, kesilebilir, ancak trabeküller olabileceğinden daha büyük pembe doku iplikçikleri kesilemez.
Sağ ventrikülü açığa çıkarmak için sağ ventrikül üçgeninin serbest duvarını çanağa sabitleyin. İnce künt uçlu erimiş cam pipet kullanarak, açıkta kalan endokardda basınç uygulamadan bağımsız trabekülleri arayın. Üçgen papiller kaslardan kaçının ve genellikle sağ ventrikül serbest duvarının tabanının yakınında ve septum boyunca bulunan paralel kenarlı trabekülleri seçin.
Trabekülü küçük Vannas makası kullanarak diseke edin, bağlanmaya izin vermek için trabekülün her iki ucunda bir milimetre küp doku parçası bırakın. Ardından, yedi mililitrelik bir transfer pipetinin ucundan yaklaşık iki inç kesin, trabekülü yavaşça pipetin içine çekin ve %50 perfüzyon çözeltisi ve %50 modifiye Tyrode çözeltisi içeren yeni bir tartım kabına aktarın. Kasın karışık çözelti içindeki hücre dışı kalsiyumdaki artışa birkaç dakika boyunca dengelenmesine izin verin.
Deney odasına süperfüzyon veya emme sağlayan pompayı kapatın. Büyük delikli transfer pipetini kullanarak, trabeculayı Tyrode çözeltisiyle dolu deney odasına taşıyın. Trabekülün sonundaki küp küp bir doku parçasını kuvvet dönüştürücüsündeki bir kancaya sabitleyin, ardından ikinci küpü motora sabitleyin.
Süperfüzyonu yeniden başlatın ve eşik voltajını belirlemek için kası hızlandırmaya başlayın. Yaklaşık bir saat boyunca eşik voltajının %20 üzerinde hızlayın. Bu denge periyodunun sonunda, motora bağlı mikrometreyi kullanarak kası yavaşça gerin, gelişmiş gerilimi gözlemleyerek optimal gelişmiş stres üretimi sağlanana kadar.
Pasif diyastolik gerginlik tepe gerginliğinden daha hızlı yükseldiğinde kas uzunluğunu arttırmayı bırakın, bu da optimal uzunluğun geçildiğini gösterir. İletilen mikroskop aydınlatmasını kapatın ve dik bir açıyla bir kaz boynu aydınlatıcısı kullanarak trabekülayı aydınlatın. Mikroskop optiklerine bağlı önceden kalibre edilmiş bir kamera kullanarak, diyastol sırasında trabekülün bir görüntüsünü deneysel klasöre yakalayın.
Ortalama çap ölçer ve önceden elde edilmiş bir kalibrasyonu kullanarak çap ve uzunluğu pikselden milimetreye dönüştürür. Kesit alanını ve kas uzunluğunu mikrometre cinsinden hesaplayın. Veri toplama yazılımında, dap dosyasında son yükü tanımlayarak yük sıkıştırmalı verileri elde edin ve dosyayı metin düzenleyicisine kaydederek orantılı kazanç ve entegrasyon parametrelerinin değerlerini yineleyin, ardından arayüzde "Denemeyi Çalıştır" a basın.
Modu değiştirerek yük kelepçesinin ucunu kontrol edin. Yük kelepçesinin ucunu sıfırdan tamamlamaya değiştirirken alımı tekrarlayın ve başlangıç uzunluğuna geri uzatın. Uzunluğu artırmak için, yük kelepçesini sonlandırma eşiğini sıfırdan kas neredeyse orijinal uzunluğuna geri dönene kadar kademeli olarak artırın.
İsterseniz, son yükü değiştirin ve alımı hemen tekrarlayın. İstenirse, kası gererek veya kısaltarak ön yükü değiştirin veya Tyrode'un çözeltisine bileşikler ekleyerek kası tedavi edin, ancak yavaş kuvvet tepkisinin stabilize olduğundan ve bileşiğin kaslara tamamen nüfuz ettiğinden emin olmak için en az 20 dakika bekleyin. Veri toplama işlemi tamamlandıktan sonra, trabekülayı çıkarın ve deney sistemini temizleyin.
Veri analizi programının kelepçeli atımı analiz etmesini ve programın yük kelepçesinin başlangıcını doğru bir şekilde almasını sağlayarak gevşemeyi ölçün. Belirli bir durumun tüm izlerini ölçtükten sonra, gevşeme oranı ile gerinim oranı arasındaki ilişkiyi çizin ve maksimum veriyi saniyede birden az fizyolojik gerinim oranıyla sınırlayın. Gevşeme aşaması üstel bozulmayı yansıtmayabileceğinden, verileri düşük gerinim oranlarında hariç tutun.
Gevşeme oranı ile gerinim oranı arasındaki çizginin eğimini elde edin ve eğimi gevşemenin mekanik kontrolünün indeksi olarak kaydedin. Mikroskop merceğinin ekseninden 75 derecelik dik bir açıyla kaz boynu LED ışığı kullanılarak aydınlatılan tek bir kardiyak trabekül burada gösterilmektedir. Aynı trabekül için gerilme süresi ve gerinim zaman eğrileri, artan ve sistolik gerinim oranlarında izometrik bir seğirme ve üç yük kelepçesi seğirmesi gösterdi.
Gerinim oranı, izometrik gevşemeden hemen önce gerinimin türevinden hesaplanır. Veriler, çizginin eğiminin gevşemenin mekanik kontrolünü veya MCR endeksini sağladığı bir gevşeme oranına karşı gerinim oranı grafiği üzerinde çizilir. Bu protokoldeki en zor bileşen, kardiyak trabekülün dikkatli bir şekilde izole edilmesidir.
Bu protokol, hücre içi kalsiyum, kontraktilite, sarkomer uzunluğu dahil olmak üzere diğer kas ölçümleriyle birleştirilebilir. Ayrıca, bu yöntem moleküler mekanizmaları tanımlamak ve bozulmuş kardiyak gevşemenin patofizyolojisini daha iyi anlamak için kullanılmaktadır.
