Ce protocole décrit une méthode pour mesurer le contrôle mécanique de la relaxation ou la dépendance à la tension de la relaxation musculaire dans la trabécule cardiaque. Le principal avantage de cette technique est qu’elle se concentre sur la relaxation cardiaque. Compte tenu du manque d’options de traitement pour les maladies diastoliques, cette technique pourrait être utilisée pour identifier de nouveaux indices et cibles médicamenteuses liés à la relaxation cardiaque.
Cette méthode sera montrée avec un cœur de rongeur, mais elle peut être utilisée sur n’importe quel muscle intact. Anita Abbo, assistante de recherche de premier cycle dans mon laboratoire, ferons la démonstration de cette procédure. Pour commencer, retirez le cœur du petit modèle animal grossièrement disséqué de la canule et placez-le dans un plat de pesée recouvert d’élastomère de silicone pour préparer l’isolement trabéculaire.
Ensuite, placez et illuminez le cœur sous un stéréomicroscope. Après avoir localisé le tractus d’écoulement ventriculaire droit, épinglez l’oreillette gauche et l’apex ventriculaire à l’élastomère de silicone dans le plat. À l’aide de longs ciseaux Vannas, couper du tractus d’écoulement ventriculaire droit à l’apex le long du septum.
Ensuite, coupez de la voie d’écoulement ventriculaire droite à l’oreillette droite près de l’aorte, puis coupez à travers l’oreillette droite. À l’aide d’une pince, ouvrez soigneusement la paroi libre ventriculaire droite du tractus de sortie sans étirer le tissu. Les brins minces de tissu conjonctif blanc, s’ils sont trouvés, peuvent être coupés, mais pas les plus grands brins de tissu rose, car ils peuvent être des trabécules.
Épinglez la paroi libre du triangle du ventricule droit à la capsule pour exposer le ventricule droit. À l’aide d’une fine pipette en verre fondu à extrémité émoussée, rechercher dans l’endocarde exposé des trabécules autoportantes sans appliquer de pression. Évitez les muscles papillaires triangulaires et choisissez des trabécules à côtés parallèles, qui se trouvent souvent près de la base de la paroi libre ventriculaire droite et le long du septum.
Disséquez la trabecula à l’aide de petits ciseaux Vannas, en laissant un morceau de tissu d’un millimètre cube à chaque extrémité de la trabecula pour permettre la fixation. Ensuite, coupez environ deux pouces de l’extrémité d’une pipette de transfert de sept millilitres, aspirez lentement la trabecula dans la pipette et transférez-la dans un nouveau plat de pesée, contenant une solution de perfusion à 50% et une solution de Tyrode modifiée à 50%. Laissez le muscle s’équilibrer à l’augmentation du calcium extracellulaire dans la solution mélangée pendant plusieurs minutes.
Éteignez la pompe fournissant la surfusion ou l’aspiration à la chambre expérimentale. À l’aide de la pipette de transfert de grand alésage, déplacez la trabecula dans la chambre expérimentale remplie de la solution de Tyrode. Épinglez un morceau de tissu cubique à l’extrémité de la trabecula à un crochet sur le transducteur de force, puis épinglez le deuxième cube au moteur.
Redémarrez la superfusion et commencez à rythmer le muscle pour déterminer la tension de seuil. Marcher à 20% au-dessus de la tension seuil pendant environ une heure. À la fin de cette période d’équilibre, étirez lentement le muscle à l’aide du micromètre connecté au moteur, jusqu’à ce que la génération de stress développée optimale soit obtenue en observant la tension développée.
Arrêtez d’augmenter la longueur musculaire lorsque la tension diastolique passive augmente plus rapidement que la tension maximale, indiquant que la longueur optimale a été dépassée. Éteignez l’éclairage du microscope transmis et illuminez la trabecula à l’aide d’un illuminateur à col de cygne à un angle raide. À l’aide d’une caméra préalablement calibrée connectée via l’optique du microscope, capturez une image de la trabecula pendant la diastole dans le dossier expérimental.
Faites la moyenne des mesures de diamètre et convertissez le diamètre et la longueur des pixels en millimètres à l’aide d’un étalonnage obtenu précédemment. Calculez la section transversale et la longueur du muscle en micromètres. Dans le logiciel d’acquisition de données, acquérez les données de compression de charge en définissant la postcharge dans le fichier dap et itérez les valeurs de gain proportionnel et les paramètres d’intégration en enregistrant le fichier dans l’éditeur de texte, puis appuyez sur Run Experiment dans l’interface.
Contrôlez l’extrémité de la pince de charge en changeant de mode. Répétez l’acquisition tout en changeant l’extrémité de la pince de charge de zéro à complète, en rallongeant à la longueur de départ. Pour augmenter la longueur, augmentez progressivement le seuil de fin de la pince de charge de zéro jusqu’à ce que le muscle s’allonge presque à sa longueur d’origine.
Si vous le souhaitez, modifiez la postcharge et répétez l’acquisition immédiatement. Si vous le souhaitez, modifiez la précharge en étirant ou en raccourcissant le muscle, ou traitez le muscle en ajoutant des composés à la solution de Tyrode, mais attendez au moins 20 minutes pour vous assurer que la réponse lente de la force s’est stabilisée et que le composé pénètre complètement dans le muscle. Une fois l’acquisition des données terminée, retirez le trabecula et nettoyez le système expérimental.
Quantifier la relaxation en s’assurant que le programme d’analyse des données analyse le battement serré et que le programme acquiert correctement le début de la pince de charge. Après avoir quantifié toutes les traces d’une condition donnée, tracez la relation entre le taux de relaxation et le taux de déformation, en limitant les données maximales à un taux de déformation physiologique inférieur à un par seconde. Exclure les données à faible taux de déformation, car la phase de relaxation peut ne pas refléter la décroissance exponentielle.
Obtenir la pente de la ligne entre la vitesse de relaxation et la vitesse de déformation, et enregistrer la pente comme indice de contrôle mécanique de la relaxation. Une seule trabecula cardiaque éclairée à l’aide d’une lumière LED col de cygne à un angle raide de 75 degrés par rapport à l’axe de la lentille du microscope est montrée ici. Les courbes de temps de contrainte et de temps de déformation pour la même trabecula ont montré une contraction isométrique et trois secousses de pince de charge à des vitesses de déformation croissantes et systoliques.
Le taux de déformation est calculé à partir de la dérivée de la déformation juste avant la relaxation isométrique. Les données sont tracées sur un graphique du taux de relaxation en fonction du taux de déformation, où la pente de la ligne fournit le contrôle mécanique de la relaxation, ou indice MCR. L’élément le plus difficile de ce protocole est une isolation soigneuse de la trabécule cardiaque.
Ce protocole peut être combiné avec d’autres mesures du muscle, y compris le calcium intracellulaire, la contractilité et la longueur du sarcomère. En outre, cette méthode est utilisée pour identifier les mécanismes moléculaires et mieux comprendre la physiopathologie de la relaxation cardiaque altérée.
