このプロトコルは、心臓小柱における弛緩の機械的制御または筋弛緩のひずみ依存性を測定する方法を記載している。この技術の主な利点は、心臓の弛緩に焦点を当てていることです。拡張期疾患の治療選択肢がないことを考えると、この手法は、心臓の弛緩に関連する新しい指標と薬物標的を特定するために使用される可能性があります。
この方法はげっ歯類の心臓で示されますが、無傷の筋肉にも使用できます。この手順を実演するのは、私と私の研究室の学部研究助手であるアニタ・アボです。まず、肉眼的に解剖した小動物モデルの心臓をカニューレから取り出し、シリコーンエラストマーでコーティングされた計量皿に入れて、小柱の分離の準備をします。
次に、実体顕微鏡で心臓を置いて照らします。右心室流出路を見つけた後、左心房と心室頂点を皿のシリコーンエラストマーに固定します。長いバンナはさみを使用して、右心室流出路から中隔に沿って頂点まで切り取ります。
次に、右心室流出路から大動脈近くの右心房まで切断し、次に右心房を切断します。鉗子を使用して、組織を伸ばさずに流出路から右心室自由壁を慎重に引き開きます。白い細い結合組織ストランドが見つかった場合、切断できますが、大きなピンク色の組織ストランドは小柱である可能性があるため、切断することはできません。
右心室三角形の自由壁を皿に固定して、右心室を露出させます。薄い鈍端の溶融ガラスピペットを使用して、圧力を加えることなく、露出した心内膜で自立性小柱を検索します。三角形の乳頭筋を避け、右心室自由壁の基部近くと中隔に沿ってよく見られる平行な側面を持つ小柱を選択します。
小さなバンナスハサミを使用して小柱を解剖し、小柱の両端に1ミリメートル立方体の組織片を残して取り付けます。次に、7ミリリットルのトランスファーピペットの端から約2インチを切り取り、小柱をゆっくりとピペットに引き込み、50%灌流溶液と50%修飾タイロード溶液を含む新しい計量皿に移します。筋肉を平衡化させて、混合溶液内の細胞外カルシウムの増加を数分間放置する。
実験室に過融合または吸引を供給するポンプをオフにします。大口径トランスファーピペットを使用して、Tyrodeの溶液で満たされた実験チャンバーに小柱を移動します。小柱の端にある1つの立方体の組織片を力変換器のフックに固定し、次に2番目の立方体をモーターに固定します。
灌流を再開し、筋肉のペーシングを開始してしきい値電圧を決定します。しきい値電圧を約20%上回るペースで約1時間。この平衡期間の終わりに、モーターに接続されたマイクロメータを使用して筋肉をゆっくりと伸ばし、発達した張力を観察することによって最適な発達応力発生が達成されるまで。
受動的な拡張期緊張がピーク張力よりも速く上昇し、最適な長さが経過したことを示す場合は、筋肉の長さの増加を停止します。透過顕微鏡照明をオフにし、グースネック照明器を使用して急角度で小柱を照らします。顕微鏡光学系を介して接続された以前に較正されたカメラを使用して、拡張期中の小柱の画像を実験フォルダにキャプチャします。
直径を測定し、以前に取得したキャリブレーションを使用して、直径と長さをピクセルからミリメートルに変換します。断面積と筋肉の長さをマイクロメートルで計算します。データ収集ソフトウェアでは、dapファイルで後負荷を定義して負荷クランプデータを取得し、テキストエディタでファイルを保存して比例ゲインと積分パラメータの値を反復し、インタフェースの[実験の実行]を押します。
モードを変更して負荷クランプの端を制御します。ロードクランプの端をゼロから完了に変更しながら、取得を繰り返し、開始長さまで再延長します。長さを長くするには、筋肉が元の長さにほぼ再延長されるまで、負荷クランプを終了するためのしきい値をゼロから段階的に増やします。
必要に応じて、アフターロードを変更し、すぐに集録を繰り返します。必要に応じて、筋肉を伸ばしたり短くしたりして予圧を変更するか、Tyrodeの溶液に化合物を追加して筋肉を治療しますが、遅い力の反応が安定し、化合物が筋肉に完全に浸透するまで、最低20分待ちます。データ取得が完了したら、小柱を取り外し、実験系を清掃します。
データ解析プログラムがクランプされたビートを分析し、プログラムが負荷クランプの開始を正しく取得するようにすることで、緩和を定量化します。特定の条件のすべての痕跡を定量化した後、緩和速度とひずみ速度の関係をプロットし、最大データを1秒あたり1未満の生理学的ひずみ速度に制限します。緩和段階は指数関数的減衰を反映していない可能性があるため、ひずみ速度が低いデータを除外します。
弛緩速度とひずみ速度の間の線の傾きを求め、その勾配を弛緩の機械的制御の指標として記録します。ここでは、グースネックLEDライトを使用して顕微鏡レンズの軸から75度の急角で照らされた単一の心臓小柱を示しています。同じ小柱の応力時間とひずみ時間曲線は、増加および収縮期のひずみ速度で等尺性けいれんと3つの荷重クランプけいれんを示しました。
ひずみ速度は、等尺性緩和直前のひずみの導関数から計算されます。データは緩和率対ひずみ速度グラフにプロットされ、線の傾きは緩和の機械的制御、つまりMCRインデックスを提供します。このプロトコルで最も難しい要素は、心臓小柱の慎重な分離です。
このプロトコルは、細胞内カルシウム、収縮性、サルコメア長など、筋肉の他の測定値と組み合わせることができます。また、この方法は、分子メカニズムを特定し、心臓弛緩障害の病態生理学をよりよく理解するために使用されています。
