Questo protocollo descrive un metodo per misurare il controllo meccanico del rilassamento o la dipendenza da sforzo del rilassamento muscolare nella trabecola cardiaca. Il principale vantaggio di questa tecnica è che si concentra sul rilassamento cardiaco. Data la mancanza di opzioni di trattamento per le malattie diastoliche, questa tecnica potrebbe essere utilizzata per identificare nuovi indici e bersagli farmacologici relativi al rilassamento cardiaco.
Questo metodo sarà mostrato con un cuore di roditore, ma può essere utilizzato su qualsiasi muscolo intatto. A dimostrare questa procedura saremo io e Anita Abbo, un'assistente di ricerca universitaria nel mio laboratorio. Per iniziare, rimuovere il cuore del piccolo modello animale sezionato dalla cannula e posizionarlo in un piatto di pesatura rivestito in elastomero siliconico per prepararsi all'isolamento trabecolare.
Quindi posizionare e illuminare il cuore sotto uno stereomicroscopio. Dopo aver individuato il tratto di efflusso ventricolare destro, fissare l'atrio sinistro e l'apice ventricolare all'elastomero siliconico nel piatto. Usando lunghe forbici Vannas, tagliare dal tratto di efflusso ventricolare destro all'apice lungo il setto.
Quindi, tagliare dal tratto di deflusso ventricolare destro all'atrio destro vicino all'aorta, quindi tagliare l'atrio destro. Usando una pinza, aprire con attenzione la parete libera ventricolare destra dal tratto di deflusso senza allungare il tessuto. I sottili fili di tessuto connettivo bianco, se trovati, possono essere tagliati, ma non i fili di tessuto rosa più grandi, in quanto potrebbero essere trabecole.
Appuntare la parete libera del triangolo del ventricolo destro al piatto per esporre il ventricolo destro. Utilizzando una sottile pipetta di vetro fuso con estremità smussata, cercare trabecole autoportanti nell'endocardio esposto senza applicare pressione. Evitare i muscoli papillari triangolari e selezionare trabecole con lati paralleli, che si trovano spesso vicino alla base della parete libera ventricolare destra e lungo il setto.
Sezionare la trabecola usando piccole forbici Vannas, lasciando un pezzo di tessuto di un millimetro cubo a ciascuna estremità della trabecola per consentire l'attaccamento. Quindi, tagliare circa due pollici dall'estremità di una pipetta di trasferimento da sette millilitri, aspirare lentamente la trabecola nella pipetta e trasferirla in un nuovo piatto di pesatura, contenente il 50% di soluzione di perfusione e il 50% di soluzione di Tyrode modificata. Consentire al muscolo di equilibrarsi all'aumento del calcio extracellulare all'interno della soluzione miscelata Per diversi minuti.
Spegnere la pompa che fornisce la superfusione o l'aspirazione alla camera sperimentale. Utilizzando la pipetta di trasferimento a foro grande, spostare la trabecola nella camera sperimentale riempita con la soluzione di Tyrode. Appuntare un pezzo di tessuto cubico all'estremità della trabecola su un gancio sul trasduttore di forza, quindi appuntare il secondo cubo al motore.
Riavvia la superfusione e inizia a stimolare il muscolo per determinare la tensione di soglia. Andare al 20% al di sopra della tensione di soglia per circa un'ora. Alla fine di questo periodo di equilibrio, allungare lentamente il muscolo usando il micrometro collegato al motore, fino a ottenere una generazione ottimale di stress sviluppato osservando la tensione sviluppata.
Smettere di aumentare la lunghezza del muscolo quando la tensione diastolica passiva aumenta più velocemente della tensione di picco, indicando che la lunghezza ottimale è stata superata. Spegnere l'illuminazione del microscopio trasmesso e illuminare la trabecola usando un illuminatore a collo d'oca con un angolo ripido. Utilizzando una fotocamera precedentemente calibrata collegata attraverso l'ottica del microscopio, catturare un'immagine della trabecola durante la diastole nella cartella sperimentale.
Calcola la media delle misure di diametro e converti il diametro e la lunghezza da pixel a millimetri utilizzando una calibrazione ottenuta in precedenza. Calcola l'area della sezione trasversale e la lunghezza del muscolo in micrometri. Nel software di acquisizione dati, acquisire i dati bloccati del carico definendo l'afterload nel file dap e iterare i valori del guadagno proporzionale e dei parametri di integrazione salvando il file nell'editor di testo, quindi premere Run Experiment" nell'interfaccia.
Controllare l'estremità del morsetto di carico cambiando la modalità. Ripetere l'acquisizione modificando l'estremità del morsetto di carico da zero a completa, allungando nuovamente alla lunghezza iniziale. Per aumentare la lunghezza, aumentare in modo incrementale la soglia per terminare il morsetto di carico da zero fino a quando il muscolo si allunga quasi alla sua lunghezza originale.
Se lo si desidera, modificare il postcarico e ripetere immediatamente l'acquisizione. Se lo si desidera, modificare il precarico allungando o accorciando il muscolo, o trattare il muscolo aggiungendo composti alla soluzione del Tyrode, ma attendere almeno 20 minuti per assicurarsi che la risposta alla forza lenta si sia stabilizzata e che il composto penetri completamente nel muscolo. Una volta completata l'acquisizione dei dati, rimuovere la trabecola e pulire il sistema sperimentale.
Quantificare il rilassamento assicurando che il programma di analisi dei dati analizzi il battito bloccato e che il programma acquisisca correttamente l'inizio della pinza di carico. Dopo aver quantificato tutte le tracce di una determinata condizione, tracciare la relazione tra la velocità di rilassamento e la velocità di deformazione, limitando i dati massimi a una velocità di deformazione fisiologica inferiore a una al secondo. Escludere i dati a basse velocità di deformazione, poiché la fase di rilassamento potrebbe non riflettere il decadimento esponenziale.
Ottenere la pendenza della linea tra la velocità di rilassamento e la velocità di deformazione e registrare la pendenza come indice di controllo meccanico del rilassamento. Qui viene mostrata una singola trabecola cardiaca illuminata utilizzando una luce LED a collo d'oca con un angolo ripido di 75 gradi dall'asse della lente del microscopio. Le curve del tempo di sollecitazione e del tempo di deformazione per la stessa trabecola hanno mostrato una contrazione isometrica e tre contrazioni del morsetto di carico a velocità di deformazione crescente e sistolica.
La velocità di deformazione viene calcolata dalla derivata della deformazione appena prima del rilassamento isometrico. I dati sono tracciati su un grafico della velocità di rilassamento rispetto alla velocità di deformazione, dove la pendenza della linea fornisce il controllo meccanico del rilassamento, o indice MCR. Il componente più difficile in questo protocollo è un attento isolamento della trabecola cardiaca.
Questo protocollo può essere combinato con altre misurazioni del muscolo, tra cui calcio intracellulare, contrattilità e lunghezza del sarcomero. Inoltre, questo metodo viene utilizzato per identificare i meccanismi molecolari e comprendere meglio la fisiopatologia del rilassamento cardiaco compromesso.
