يحدث ارتفاع تراكم الحديد في الدماغ في BPAN بسبب خلل في بروتين الالتهام الذاتي. لكن الآليات الجزيئية الأساسية غير معروفة. يوفر هذا البروتوكول تقييما لتدهور الفيريتين الليزوزومي ، مثل ferritinophagy.
تقدم هذه التقنية طريقة التحليل الكمي القائم على الصور لقياس تدهور الفيريتين الليزوزومي في الخلايا المفردة. بشكل ملائم ، يمكن توسيع نهج تعدد الإرسال من خلال تضمين الأجسام المضادة أو الأصباغ المناسبة لقياس المعلمات الخلوية الإضافية. يمكن لهذه الطريقة تحديد وتمييز المسارات المعتمدة على الالتهام الذاتي والمستقلة لتدهور الفيريتين الليزوزومي.
من المهم فهم توازن الحديد المختل وظيفيا في BPAN على المستوى الخلوي. ستوضح طالبة الدكتوراه لدينا ، كارمن باستور مالدونادو ، طريقة تحليل تحلل الفيريتين الليزوزومي ، مثل الفيريتينوفاجي. ابدأ التثبيت الذاتي عن طريق استنشاق وسط العلاج من خلايا التنكس العصبي المرتبطة بمروحة بيتا المشتقة من المريض والموجودة في صفيحة زجاجية ذات قاع 96 بئرا ، وغسلها مرتين بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات من Dulbecco ، أو DPBS.
أضف 100 ميكرولتر من 3.7٪ بارافورمالدهيد ، أو PFA ، لكل بئر قبل تثبيت الخلايا لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام. بعد 20 دقيقة ، قم بإزالة PFA واغسل الخلايا مرتين باستخدام PBST قبل سد الخلايا الموجودة في PBST التي تحتوي على 1٪ من ألبومين مصل الأبقار ، أو BSA ، لمدة ساعة واحدة عند أربع درجات مئوية. بعد ذلك ، اغسل الخلايا مرتين باستخدام PBST قبل تطبيق 50 ميكرولترا من مزيج الأجسام المضادة الأساسي المحضر في PBST لكل بئر.
لف الألواح مع parafilm ، واحتضان بين عشية وضحاها في أربع درجات مئوية. في صباح اليوم التالي ، قم بإعداد مزيج الأجسام المضادة الثانوي في PBST بنسبة واحد إلى 200. بعد غسل الخلايا مرتين باستخدام PBST ، ضع 50 ميكرولترا من مزيج الأجسام المضادة الثانوية الطازجة لكل بئر.
احتضان الخلايا عند أربع درجات مئوية لمدة ساعة واحدة في الظلام. مرة أخرى ، قم بغسلتين باستخدام PBST ، وأضف 100 ميكرولتر من خمسة ميكروغرام طازجة لكل ميكرولتر من محلول 4'6-diamidino-2-phenylinدول ، أو DAPI ، لكل بئر واحتضان اللوحة. أعط غسلتين من PBS قبل إضافة 50 ميكرولترا من PBS إلى كل بئر ، ثم احتضن الألواح الملفوفة عند أربع درجات في الظلام.
للتصوير الآلي للخلايا ، استبدل PBS في اللوحة ب 50 ميكرولتر من PBS الطازج في درجة حرارة الغرفة. قم بتغطية اللوحة بورق الألمنيوم لنقلها إلى غرفة الفحص المجهري. قم بتشغيل مجهر المسح بالليزر متحد البؤر ، واضبط حامل عينة لألواح 96 بئرا على طاولة المجهر ، وحدد هدفا 40x.
اضبط إعدادات التصوير عن طريق تحديد أشعة الليزر والمرشحات في الإعداد الذكي ، وتعيين المسارات للحصول على جودة وسرعة صورة مثالية. لتحديد نوع التجربة ، انقر فوق "البلاط" لتمكين خيار التحديد وحفظ مواضع XY المحددة على اللوحة. في وحدة إعداد التصوير ، تصور قنوات الاستحواذ والمسارات المخصصة وأطوال موجات الإثارة والانبعاث.
في وحدة وضع الاستحواذ ، حدد سرعة المسح الضوئي "كستة ، والاتجاه" كثنائي الاتجاه ، والمتوسط "ك 2x ، والبت لكل بكسل" على أنه ثمانية. في وحدة القنوات ، قم بضبط طاقة الليزر والثقب والكسب الرئيسي لكل قناة على حدة للحصول على صور معرضة بشكل صحيح دون الإفراط في تشبعها. بعد ذلك ، انقر فوق وحدة "استراتيجية التركيز" وحدد الجمع بين التركيز التلقائي للبرنامج والتركيز المحدد.
ضمن القناة المرجعية والإزاحة، حدد القناة الأكثر استقرارا وسطوعا كمرجع. ضمن تكرار حدث التثبيت وتكراره، حدد قياسي. في وحدة التركيز البؤري التلقائي للبرنامج ، حدد الوضع "ككثافة ، والبحث" كذكي ، وأخذ العينات "على أنه جيد" والنطاق النسبي.
بعد ذلك ، انقر فوق وحدة البلاط. حدد المناصب كمراكز فردية. ضمن الإعداد المتقدم ، انتقل عبر اللوحة ، وحدد موضعا للتصوير ، وانقر فوق الزر الموجود أسفل علامة التبويب إعداد الموضع.
لتسمية كل موضع بمعلومات إضافية ، افتح علامة التبويب "خصائص" وانقر على أيقونة العجلة بجوار القائمة المنسدلة للفئة ، ثم انقر فوق "جديد" لفتح مربع حوار جديد لإدخال اسم فئة جديد. لتعيين فئة لموضع معين ، حدد الموضع ، وانقر فوق علامة التبويب "خصائص" ، وانتقل إلى القائمة المنسدلة الفئات وحدد التسمية المقابلة. ضمن حامل العينة، حدد القاع الزجاجي Multiwell 96 Cellvis 0.
انقر فوق معايرة "لمعايرة المجهر على سطح اللوحة. اختر بين معايرة نقطة واحدة أو سبع نقاط حسب مواصفات النظام. ضمن خيارات، حدد تداخل تجانب بنسبة 10٪ضمن السفر في مناطق التجانب، حدد تجميع"وحدد استخدام سرعة المرحلة من التحكم في المرحلة، واستخدام تسريع المرحلة من التحكم في المرحلة" وهرم الصورة أثناء الاستحواذ.
بمجرد الانتهاء من ذلك ، قم بتشغيل الحصول على الصور ، واحفظ نتائج الصورة كملف CZI ، والبيانات الوصفية للصورة كملفات CSV على محرك أقراص ثابت محمول. تصدير الصور كملفات TIF. قم بإنشاء ملف جدول بيانات تعريف منفصل لتحليل الصور عالية الإنتاجية مع أعمدة الموضع والبئر والشرط والسلسلة والمجموعة.
استرجع البيانات المناسبة من ملف بيانات التعريف الأصلي الذي يأتي من الفحص المجهري للمسح بالليزر متحد البؤر ، واملأ هذه الأعمدة. قم بتشغيل CellProfiler 4.2.4 بالنقر المزدوج واستيراد خط أنابيب CellProfiler عن طريق السحب والإفلات. قبل تكييف خط أنابيب CellProfiler، قم بسحب وإفلات ملفات صور CZI الفردية، أو مجلد يحتوي على ملفات صور CZI متعددة، إلى وحدة الصورة.
في وحدة NamesAndTypes" ، استبدل رمز C1-C3 برمز يسمح للبرنامج بتحديد وفرز الصور أحادية القناة المراد تحليلها. لتحسين الإدخالات الرقمية في الوحدات النمطية، قم بضبط إعدادات خط الأنابيب للوحدات النمطية IdentifyPrimaryObjects"و IdentifySecondaryObjects". لتتبع التعديلات ، حدد خيار وضع الاختبار بالنقر فوق الزر "بدء وضع الاختبار" ، أو بدلا من ذلك ، الزر "خطوة" بين الوحدات A.سيؤدي ذلك إلى نافذة منبثقة توضح كيفية تحليل الصورة باستخدام هذه الإعدادات.
اضبط الإعدادات بدقة للتعرف الأمثل. بمجرد تحسين خط الأنابيب ، قم بإنهاء وضع الاختبار وتنفيذ التحليل عن طريق تنشيط وضع اختبار الخروج "قبل النقر فوق الزر "تحليل الصور". بعد التحليل ، تحقق من دقة اكتشاف الخلية والنقاط من خلال مقارنة الصور المدخلة بمخرجات التراكب التي تم إنشاؤها بواسطة CellProfiler.
إذا لم تكن مرضية ، اضبط القيم العددية في الوحدات المختلفة حتى تكون نتيجة التحليل دقيقة بما فيه الكفاية. جعلت هذه التقنية التعرف على الخلايا القائم على البرامج والتعرف على الفيريتين و LAMP2 ممكنا. عندما تم حظر التحلل الليزوزومي للفيريتين عن طريق إضافة بافيلوميسين A1 ، زاد التوطين المشترك للفيريتين الداخلي في LAMP2.
كانت الزيادة متسقة مع قدرته على تثبيط إنزيمات V-ATPase الليزوزومية التي تمنع الإصابة بالحديديات. يعد التلوين المناعي عالي الجودة إلزاميا لتحليل الصور بدقة وتلقائية ، لذلك ينصح بإجراء تجربة أولية لاختبار أشياء مثل تخفيفات الأجسام المضادة وكثافة الخلايا. يمكن توسيع هذا البروتوكول لإجراء تحليل ضوئي ومجهري إلكتروني مترابط.
لهذا ، يمكن استخلاص استنتاجات دقيقة ، ولكن نوع تدهور الفيريتين الليزوزومي ، على سبيل المثال ، عن طريق ferritinophagy أو مسارات مستقلة عن الالتهام الذاتي. يتم اختبار هذه الاستراتيجيات لتحديد ما إذا كان بإمكانها التقاط السلوك الخلوي المحدد للخلايا المشتقة من BPAN ، والفرق عن الخلايا أين. غير متحور.
هذه الطريقة هي جزء من هذا التطور.
