Eine hohe Eisenakkumulation im Gehirn in BPAN wird durch eine Dysfunktion des Autophagie-Proteins verursacht. Die zugrundeliegenden molekularen Mechanismen sind jedoch unbekannt. Dieses Protokoll bietet eine Bewertung des lysosomalen Ferritinabbaus, wie z. B. Ferritinophagie.
Diese Technik bietet die quantitative, bildbasierte Analysemethode zur Messung des lysosomalen Ferritinabbaus in einzelnen Zellen. Praktischerweise kann der Multiplex-Ansatz erweitert werden, indem geeignete Antikörper oder Farbstoffe zur Messung zusätzlicher zellulärer Parameter einbezogen werden. Mit dieser Methode können autophagieabhängige und unabhängige Signalwege für den lysosomalen Ferritinabbau identifiziert und differenziert werden.
Es ist wichtig für das Verständnis der dysfunktionalen Eisenhomöostase in BPAN auf zellulärer Ebene. Unsere Doktorandin, Carmen Pastor-Maldonado, wird die Methode zur Analyse des lysosomalen Ferritinabbaus, wie z.B. der Ferritinophagie, demonstrieren. Beginnen Sie die Selbstfixierung, indem Sie das Behandlungsmedium aus den vom Patienten stammenden, Beta-Propeller-assoziierten Neurodegenerationszellen aspirieren, die in einer 96-Well-Platte mit Glasboden sitzen, und sie zweimal mit Dulbeccos phosphatgepufferter Kochsalzlösung (DPBS) waschen.
Fügen Sie 100 Mikroliter 3,7 % Paraformaldehyd oder PFA pro Vertiefung hinzu, bevor Sie die Zellen 20 Minuten lang bei Raumtemperatur in der Dunkelheit fixieren. Entfernen Sie nach 20 Minuten das PFA und waschen Sie die Zellen zweimal mit PBST, bevor Sie die Zellen eine Stunde lang bei vier Grad Celsius in PBST mit 1 % Rinderserumalbumin oder BSA blockieren. Waschen Sie anschließend die Zellen zweimal mit PBST, bevor Sie 50 Mikroliter des in PBST hergestellten Primärantikörpermixes pro Vertiefung auftragen.
Wickeln Sie die Platten mit Parafilm ein und inkubieren Sie sie über Nacht bei vier Grad Celsius. Bereiten Sie am nächsten Morgen den Sekundärantikörpermix in PBST im Verhältnis eins zu 200 vor. Nach zweimaligem Waschen der Zellen mit PBST werden 50 Mikroliter des frisch zubereiteten Sekundärantikörpermixes pro Vertiefung aufgetragen.
Inkubieren Sie die Zellen bei vier Grad Celsius für eine Stunde im Dunkeln. Geben Sie auch hier zwei Waschgänge mit PBST und fügen Sie 100 Mikroliter frisch zubereitete fünf Mikrogramm pro Mikroliter 4'6-Diamidino-2-phenylindol oder DAPI-Lösung pro Vertiefung hinzu und inkubieren Sie die Platte. Geben Sie zwei PBS-Waschungen, bevor Sie 50 Mikroliter PBS in jede Vertiefung geben, und inkubieren Sie dann die eingewickelten Platten bei vier Grad im Dunkeln.
Für eine automatisierte Bildgebung der Zellen ersetzen Sie das PBS in der Platte durch 50 Mikroliter frisches PBS bei Raumtemperatur. Decken Sie die Platte mit Alufolie ab, um sie in den Mikroskopieraum zu bringen. Schalten Sie das konfokale Laser-Scanning-Mikroskop ein, stellen Sie einen Probenhalter für 96-Well-Platten auf den Mikroskoptisch und wählen Sie ein 40-fach-Objektiv aus.
Passen Sie die Bildgebungseinstellungen an, indem Sie die Laser und Filter in Smart Setup auswählen und die Spuren für optimale Bildqualität und -geschwindigkeit zuweisen. Um die Art des Experiments auszuwählen, klicken Sie auf Kacheln, um die Auswahloption zu aktivieren und die ermittelten XY-Positionen auf der Platte zu speichern. Visualisieren Sie im Modul "Imaging Setup" die Erfassungskanäle, die zugeordneten Spuren und deren Anregungs- und Emissionswellenlängen.
Wählen Sie im Modul "Erfassungsmodus" die Option "Scangeschwindigkeit" als sechs, "Richtung" als bidirektional, Mittelwertbildung als 2x und Bits pro Pixel" als acht. Im Kanalmodul können Sie die Laserleistung, die Lochblende und die Master-Verstärkung für jeden Kanal einzeln feinabstimmen, um korrekt belichtete Bilder zu erzielen, ohne sie zu übersättigen. Klicken Sie anschließend auf das Modul "Fokusstrategie" und wählen Sie "Software-Autofokus und Definitivfokus kombinieren".
Wählen Sie unter Referenzkanal und Offsets den stabilsten und hellsten Kanal als Referenz aus. Wählen Sie unter Wiederholungen und Häufigkeit von Stabilisierungsereignissen die Option Standard aus. Wählen Sie im Modul "Software-Autofokus" "Modus" als Intensität, "Suche" als Smart, Sampling" als Fein" und Relativer Bereich.
Klicken Sie anschließend auf das Modul Kacheln. Wählen Sie Positionen als Einzelpositionen aus. Navigieren Sie unter "Erweitertes Setup" durch die Platte, identifizieren Sie eine Position für die Bildgebung und klicken Sie auf die Schaltfläche auf der Registerkarte "Position Setup".
Um jede Position mit zusätzlichen Informationen zu beschriften, öffnen Sie die Registerkarte "Eigenschaften" und klicken Sie auf das Radsymbol neben dem Dropdown-Menü "Kategorie" und dann auf "Neu", um ein neues Dialogfeld zu öffnen und einen neuen Kategorienamen einzugeben. Um eine Kategorie einer bestimmten Position zuzuweisen, wählen Sie die Position aus, klicken Sie auf die Registerkarte "Eigenschaften", gehen Sie zum Dropdown-Menü "Kategorien" und wählen Sie das entsprechende Label aus. Wählen Sie unter Probenträger die Option Multiwell 96 Cellvis Glasboden 0 aus.
Klicken Sie auf "Kalibrieren", um das Mikroskop auf die Plattenoberfläche zu kalibrieren. Wählen Sie je nach Systemspezifikation zwischen einer Ein- oder Siebenpunktkalibrierung. Wählen Sie unter "Optionen" eine Kachelüberlappung von 10 % aus. Wählen Sie unter "Verfahrweg in Kachelbereichen" die Option "Kamm" aus und aktivieren Sie "Bühnengeschwindigkeit aus Bühnensteuerung verwenden", "Bühnenbeschleunigung aus Bühnensteuerung verwenden" und "Bildpyramide während der Aufnahme".
Wenn Sie fertig sind, führen Sie die Bildaufnahme aus, speichern Sie die Bildergebnisse als CZI-Datei und die Bildmetadaten als CSV-Dateien auf einer tragbaren Festplatte. Exportieren Sie die Bilder als TIF-Dateien. Erstellen Sie eine separate Metadaten-Tabellenkalkulationsdatei für die Bildanalyse mit hohem Durchsatz mit den Spalten Position, Well, Bedingung, Serie und Satz.
Ersetzen Sie im Modul "NamesAndTypes" den Code C1-C3 durch einen Code, der es der Software ermöglicht, die zu analysierenden Einkanalbilder zu identifizieren und zu sortieren. Um die numerischen Einträge in den Modulen zu optimieren, optimieren Sie die Pipelineeinstellungen für die Module "IdentifyPrimaryObjects" und "IdentifySecondaryObjects". Um die Anpassungen zu verfolgen, wählen Sie die Option "Testmodus" aus, indem Sie auf die Schaltfläche "Testmodus starten" klicken, oder alternativ auf die Schaltfläche "Schritt" zwischen den Modulen A. Dies führt zu einem Popup-Fenster, das zeigt, wie ein Bild mit diesen Einstellungen analysiert werden würde.
Passen Sie die Einstellungen für eine optimale Erkennung an. Sobald die Pipeline optimiert ist, beenden Sie den Testmodus und führen Sie die Analyse aus, indem Sie die Option "Testmodus beenden" aktivieren, bevor Sie auf die Schaltfläche "Bilder analysieren" klicken. Überprüfen Sie nach der Analyse die Genauigkeit der Zellen- und Punkterkennung, indem Sie die Eingabebilder mit den von CellProfiler generierten Overlay-Ausgaben vergleichen.
Wenn dies nicht zufriedenstellend ist, passen Sie die numerischen Werte in den verschiedenen Modulen an, bis das Analyseergebnis ausreichend genau ist. Diese Technik ermöglichte die softwarebasierte Zellerkennung sowie die Ferritin- und LAMP2-Erkennung. Wenn der lysosomale Abbau von Ferritin durch Zugabe von Bafilomycin A1 blockiert wurde, nahm die Co-Lokalisation von endogenem Ferritin in LAMP2 zu.
Der Anstieg stand im Einklang mit seiner Fähigkeit, lysosomale V-ATPase-Enzyme zu hemmen, die die Ferritinophagie blockieren. Eine qualitativ hochwertige Immunfärbung ist zwingend erforderlich, um Bilder genau und automatisch analysieren zu können, daher ist es ratsam, Vorversuche durchzuführen, um Dinge wie Antikörperverdünnungen und Zelldichten zu testen. Dieses Protokoll kann erweitert werden, um korrelative Licht- und Elektronenmikroskopie-Analysen durchzuführen.
Hierfür lassen sich genaue Rückschlüsse ziehen, aber die Art des lysosomalen Ferritinabbaus beispielsweise über Ferritinophagie oder Autophagie-unabhängige Wege verlaufen. Diese Strategien werden getestet, um festzustellen, ob sie das spezifische zelluläre Verhalten von BPAN-Patientenzellen und den Unterschied zu Zellen, bei denen es sich handelt, erfassen können. Ist nicht mutiert.
Diese Methode ist Teil einer solchen Entwicklung.
