BPAN'da yüksek beyin-demir birikimi, otofaji proteininin işlev bozukluğundan kaynaklanır. Ancak altta yatan moleküler mekanizmalar bilinmemektedir. Bu protokol, ferritinofaji gibi lizozomal ferritin bozunması için bir değerlendirme sağlar.
Bu teknik, tek hücrelerde lizozomal ferritin bozunmasını ölçmek için kantitatif, görüntü tabanlı analiz yöntemini sunar. Uygun bir şekilde, multipleks yaklaşımı, ek hücresel parametreleri ölçmek için uygun antikorlar veya boyalar dahil edilerek genişletilebilir. Bu yöntem, lizozomal ferritin bozunması için otofajiye bağımlı ve bağımsız yolları tanımlayabilir ve ayırt edebilir.
Hücresel düzeyde BPAN'daki disfonksiyonel demir homeostazını anlamak için önemlidir. Doktora öğrencimiz Carmen Pastor-Maldonado, ferritinofaji gibi lizozomal ferritin bozunmasını analiz etme yöntemini gösterecek. Tedavi ortamını, cam tabanlı 96 oyuklu bir plakaya oturtulmuş hastadan türetilmiş, beta-pervane ile ilişkili nöro-dejenerasyon hücrelerinden aspire ederek ve bunları Dulbecco'nun fosfat tamponlu salini veya DPBS ile iki kez yıkayarak kendi kendine fiksasyona başlayın.
Hücreleri karanlıkta oda sıcaklığında 20 dakika sabitlemeden önce kuyu başına 100 mikrolitre %3.7 paraformaldehit veya PFA ekleyin. 20 dakika sonra, PFA'yı çıkarın ve hücreleri% 1 sığır serum albümini veya BSA içeren PBST'deki hücreleri dört santigrat derecede bir saat boyunca bloke etmeden önce PBST ile iki kez yıkayın. Daha sonra, PBST'de hazırlanan primer antikor karışımından 50 mikrolitre kuyucuk başına uygulamadan önce hücreleri PBST ile iki kez yıkayın.
Plakaları parafilm ile sarın ve gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Ertesi sabah, ikincil antikor karışımını PBST'de bire 200 oranında hazırlayın. Hücreleri PBST ile iki kez yıkadıktan sonra, oyuk başına 50 mikrolitre taze hazırlanmış ikincil antikor karışımı uygulayın.
Hücreleri karanlıkta bir saat boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Yine, PBST ile iki yıkama yapın ve 100 mikrolitre taze hazırlanmış beş mikrogram mikrolitre 4'6-diamidino-2-fenilindol veya DAPI çözeltisi ekleyin ve plakayı inkübe edin. Her bir kuyucuğa 50 mikrolitre PBS eklemeden önce iki PBS yıkama yapın, ardından sarılmış plakaları karanlıkta dört derecede inkübe edin.
Hücrelerin otomatik olarak görüntülenmesi için, plakadaki PBS'yi oda sıcaklığında 50 mikrolitre taze PBS ile değiştirin. Mikroskobu odasına aktarmak için plakayı alüminyum folyo ile örtün. Konfokal lazer tarama mikroskobunu açın, mikroskop tablasına 96 oyuklu plakalar için bir numune tutucu ayarlayın ve 40x'lik bir objektif seçin.
Smart Setup'ta lazerleri ve filtreleri seçerek ve optimum görüntü kalitesi ve hızı için izleri atayarak görüntüleme ayarlarını yapın. Deney türünü seçmek için, seçim seçeneğini etkinleştirmek ve belirlenen XY konumlarını plaka üzerine kaydetmek için "Döşemeler"e tıklayın. Imaging Setup" modülünde, alım kanallarını, atanan izleri ve bunların uyarma ve emisyon dalga boylarını görselleştirin.
Edinme Modu "modülünde, Tarama Hızı"nı altı olarak, Yön"ü çift yönlü, Ortalama"yı 2x olarak ve Piksel Başına Bit"i sekiz olarak seçin. Kanallar modülünde, aşırı doygunluğa ulaşmadan düzgün pozlanmış görüntüler elde etmek için her kanal için lazer gücüne, iğne deliğine ve ana kazancına ayrı ayrı ince ayar yapın. Ardından, Odak Stratejisi" modülüne tıklayın ve Yazılım Otomatik Odaklama ile Kesin Odağı Birleştir'i seçin.
Referans Kanalı ve Uzaklıklar altında, referans olarak en kararlı, en parlak kanalı seçin. Stabilizasyon Olayı Tekrarları ve Sıklığı altında, Standart'ı seçin. Yazılım Otofokus "modülünde, Yoğunluk olarak Mod", Akıllı, Örnekleme, "İnce" ve Göreceli Aralık olarak "Arama" seçeneğini seçin.
Ardından, Fayans" modülüne tıklayın. Pozisyonları Tek Pozisyonlar olarak seçin. Gelişmiş Kurulum altında, plakada gezinin, görüntüleme için bir konum belirleyin ve Konum Ayarı" sekmesinin altındaki düğmeye tıklayın.
Her bir konumu ek bilgilerle etiketlemek için Özellikler" sekmesini açın ve kategori açılır menüsünün yanındaki tekerlek simgesine tıklayın, ardından yeni bir kategori adı girmek üzere yeni bir iletişim kutusu açmak için Yeni'ye tıklayın. Belirli bir konuma bir kategori atamak için konumu seçin, Özellikler" sekmesine tıklayın, kategoriler açılır menüsüne gidin ve ilgili etiketi seçin. Sample Carrier (Numune Taşıyıcı) altında, Multiwell 96 Cellvis cam alt 0'ı seçin.
Mikroskobu plaka yüzeyine kalibre etmek için "Kalibre Et"e tıklayın. Sistemin özelliklerine bağlı olarak tek noktalı veya yedi noktalı kalibrasyon arasında seçim yapın. Seçenekler'in altında, %10'luk bir döşeme çakışması seçinDöşeme Bölgelerinde Seyahat'in altında, Tara'yı seçin ve Aşama Kontrolü'nden Aşama Hızını Kullan, Aşama Kontrolü'nden Aşama Hızlandırmayı Kullan" ve Alma Sırasında Görüntü Piramidi'ni işaretleyin.
Tamamlandığında, görüntü alımını çalıştırın, görüntü sonuçlarını CZI dosyası olarak ve görüntü meta verilerini taşınabilir bir sabit sürücüde CSV dosyaları olarak kaydedin. Görüntüleri TIF dosyaları olarak dışa aktarın. Konum, kuyu, durum, seri ve küme sütunlarıyla yüksek verimli görüntü analizi için ayrı bir meta veri elektronik tablo dosyası oluşturun.
Konfokal lazer tarama mikroskobundan gelen orijinal meta veri dosyasından uygun verileri alın ve bu sütunları doldurun. Çift tıklayarak CellProfiler 4.2.4'ü başlatın ve CellProfiler işlem hattını sürükleyip bırakarak içe aktarın. CellProfiler işlem hattını uyarlamadan önce, tek tek CZI görüntü dosyalarını veya birden çok CZI görüntü dosyası içeren bir klasörü görüntü modülüne sürükleyip bırakın.
NamesAndTypes" modülünde, C1-C3 kodunu, yazılımın analiz edilecek tek kanallı görüntüleri tanımlamasına ve sıralamasına izin veren bir kodla değiştirin. Modüllerdeki sayısal girişleri iyileştirmek için IdentifyPrimaryObjects" ve IdentifySecondaryObjects" modülleri için işlem hattı ayarlarını ayarlayın. Ayarlamaları izlemek için, Test Modunu Başlat "düğmesine veya alternatif olarak modüller arasındaki "Adım" düğmesine tıklayarak test modu seçeneğini seçin A.Bu, bir görüntünün bu ayarlarla nasıl analiz edileceğini gösteren bir açılır pencere ile sonuçlanacaktır.
Optimum tanıma için ayarlarda ince ayar yapın. Boru hattı optimize edildikten sonra, test modunu sonlandırın ve Görüntüleri Analiz Et "düğmesine tıklamadan önce Test Modundan Çık" seçeneğini etkinleştirerek analizi gerçekleştirin. Analizden sonra, giriş görüntülerini CellProfiler tarafından oluşturulan bindirme çıkışlarıyla karşılaştırarak hücre ve puncta algılama doğruluğunu doğrulayın.
Tatmin edici değilse, analiz sonucu yeterince doğru olana kadar farklı modüllerdeki sayısal değerleri ayarlayın. Bu teknik, yazılım tabanlı hücre tanımayı ve ferritin ve LAMP2 tanımayı mümkün kıldı. Ferritinin lizozomal bozunması bafilomisin A1 eklenerek bloke edildiğinde, LAMP2'de endojen ferritinin ko-lokalizasyonu artmıştır.
Artış, ferritinofajiyi bloke eden lizozomal V-ATPaz enzimlerini inhibe etme kabiliyeti ile tutarlıydı. Görüntüleri doğru ve otomatik olarak analiz etmek için yüksek kaliteli immün boyama zorunludur, bu nedenle antikor seyreltmeleri ve hücre yoğunlukları gibi şeyleri test etmek için ön deney yapılması tavsiye edilir. Bu protokol, bağıntılı ışık ve elektron mikroskobu analizi yapmak için genişletilebilir.
Bunun için kesin sonuçlar çıkarılabilir, ancak lizozomal ferritin bozunmasının türü, örneğin ferritinofaji veya otofajiden bağımsız yollar yoluyla. Bu stratejiler, BPAN hastadan türetilen hücrelerin spesifik hücresel davranışını yakalayıp yakalayamayacaklarını ve hücrelerden farkı belirlemek için test edilmektedir. Mutasyona uğramaz.
Bu yöntem, bu tür bir gelişmenin bir parçasıdır.
