הצטברות גבוהה של ברזל במוח ב-BPAN נגרמת על-ידי תפקוד לקוי של חלבון האוטופגיה. אבל המנגנונים המולקולריים הבסיסיים אינם ידועים. פרוטוקול זה מספק הערכה לפירוק פריטין ליזוזומלי, כגון פריטינופגיה.
טכניקה זו מציעה את שיטת הניתוח הכמותית, מבוססת התמונה, למדידת פירוק פריטין ליזוזומלי בתאים בודדים. באופן נוח, ניתן להרחיב את גישת המרבב על ידי הכללת נוגדנים או צבעים מתאימים למדידת פרמטרים תאיים נוספים. שיטה זו יכולה לזהות ולהבדיל בין מסלולים תלויי אוטופגיה ובלתי תלויים לפירוק פריטין ליזוזומלי.
הוא חשוב להבנת הומאוסטזיס ברזל לא מתפקד ב-BPAN ברמה התאית. הדוקטורנטית שלנו, כרמן פסטור-מלדונדו, תדגים את השיטה לניתוח פירוק פריטין ליזוזומלי, כגון פריטינופגיה. התחל את הקיבוע העצמי על ידי שאיפת מדיום הטיפול מתאי ניוון עצבי הקשורים למדחף בטא שמקורם במטופל היושבים בצלחת בעלת תחתית זכוכית של 96 בארות, ושטיפתם פעמיים עם מלח חוצץ פוספט של דולבקו, או DPBS.
הוסיפו 100 מיקרוליטר של 3.7% פרפורמלדהיד, או PFA, לכל באר לפני שקיבעו את התאים למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר בחושך. לאחר 20 דקות, הסירו את ה-PFA ושטפו את התאים פעמיים עם PBST לפני חסימת התאים ב-PBST המכילים אלבומין בסרום בקר 1%, או BSA, למשך שעה אחת בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן, לשטוף את התאים פעמיים עם PBST לפני החלת 50 מיקרוליטר של תערובת נוגדנים ראשונית מוכן PBST לכל באר.
עוטפים את הצלחות בפרפילם, ודגרים למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס. למחרת בבוקר, הכינו את תערובת הנוגדנים המשנית ב-PBST ביחס של אחד ל-200. לאחר שטיפת התאים פעמיים עם PBST, להחיל 50 מיקרוליטר של תערובת נוגדנים משנית מוכן טרי לכל באר.
דוגרים על התאים בארבע מעלות צלזיוס למשך שעה אחת בחושך. שוב, לתת שתי שטיפות עם PBST, ולהוסיף 100 מיקרוליטר של חמישה מיקרוגרם טרי מוכן לכל מיקרוליטר של 4'6-diamidino-2-phenylindole, או DAPI, פתרון לכל באר לדגור את הצלחת. תן שתי שטיפות PBS לפני הוספת 50 מיקרוליטר PBS לכל באר, ולאחר מכן לדגור על הצלחות העטופות בארבע מעלות בחושך.
להדמיה אוטומטית של התאים, החלף את PBS בצלחת ב- 50 מיקרוליטר PBS טרי בטמפרטורת החדר. מכסים את הצלחת ברדיד אלומיניום כדי להעביר אותה לחדר המיקרוסקופ. הפעל את המיקרוסקופ הסורק לייזר קונפוקלי, הגדר מחזיק דגימה עבור לוחות 96 בארות על שולחן המיקרוסקופ, ובחר מטרה של 40x.
התאם את הגדרות ההדמיה על-ידי בחירת הלייזרים והמסננים בהגדרה חכמה, והקצאת הרצועות לקבלת איכות תמונה ומהירות מיטביות. כדי לבחור את סוג הניסוי, לחץ על אריחים"כדי להפעיל את אפשרות הבחירה ולשמור את מיקומי XY שנקבעו על הצלחת. במודול Imaging Setup, דמיינו את ערוצי הרכישה, את המסלולים שהוקצו ואת אורכי גל העירור והפליטה שלהם.
במודול מצב רכישה, בחר מהירות סריקה "כשש", כיוון "כדו-כיווני", ממוצע "כ-2x וסיביות לפיקסל" כשמונה. במודול הערוצים, כוונן את עוצמת הלייזר, חור הסיכה והרווח הראשי עבור כל ערוץ בנפרד כדי להשיג תמונות חשופות כראוי מבלי להרוות אותן יתר על המידה. לאחר מכן, לחץ על המודול אסטרטגיית מיקוד ובחר שלב מיקוד אוטומטי של תוכנה ומיקוד מוגדר.
תחת ערוץ התייחסות והסטות, בחר את הערוץ היציב והבהיר ביותר כהפניה. תחת חזרות ותדירות של אירועי ייצוב, בחר רגיל. במודול המיקוד האוטומטי של התוכנה, בחר מצב"כעוצמה, חיפוש"כחכם, דגימה"כעדינות" וטווח יחסי.
לאחר מכן, לחץ על האריחים"מודול. בחר מיקומים כמיקומים בודדים. תחת הגדרות מתקדמות, נווט בין הלוח, זהה מיקום להדמיה ולחץ על הכפתור תחת הכרטיסייה הגדרת מיקום.
כדי לתייג כל מיקום במידע נוסף, פתח את הכרטיסייה מאפיינים ולחץ על סמל הגלגל לצד התפריט הנפתח של הקטגוריה, ולאחר מכן לחץ על חדש"כדי לפתוח תיבת דו-שיח חדשה כדי להזין שם קטגוריה חדש. כדי להקצות קטגוריה למיקום מסוים, בחר את העמדה, לחץ על הכרטיסייה מאפיינים", עבור לתפריט הנפתח קטגוריות ובחר את התווית המתאימה. תחת ספק דוגמה, בחר Multiwell 96 Cellvis glass bottom 0.
לחץ על כיול" כדי לכייל את המיקרוסקופ למשטח הצלחת. בחר בין כיול של נקודה אחת או שבע נקודות בהתאם למפרט המערכת. תחת אפשרויות, בחר חפיפת אריחים של 10%תחת תנועה באזורי אריחים, בחר מסרק" וסמן את השתמש במהירות שלב מתוך בקרת שלב, השתמש בהאצת שלב מבקרת שלב" ופירמידת תמונות במהלך רכישה.
לאחר שתסיים, הפעל רכישת תמונה, שמור את תוצאות התמונה כקובץ CZI ואת המטא-נתונים של התמונה כקבצי CSV בכונן קשיח נייד. ייצא את התמונות כקובצי TIF. צור קובץ מטא-נתונים נפרד של גיליון אלקטרוני לניתוח תמונות בתפוקה גבוהה עם עמודות המיקום, הטוב, התנאי, הסדרה והערכה.
אחזר את הנתונים המתאימים מקובץ המטא-נתונים המקורי שמקורו במיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי, ומלא עמודות אלה. הפעל את CellProfiler 4.2.4 על ידי לחיצה כפולה וייבוא צינור CellProfiler על ידי גרירה ושחרור. לפני התאמת הצינור CellProfiler, גרור ושחרר קובצי תמונת CZI בודדים, או תיקייה המכילה קובצי תמונת CZI מרובים, למודול התמונה.
במודול NamesAndTypes", החלף את קוד C1-C3 בקוד המאפשר לתוכנה לזהות ולמיין את התמונות החד-ערוציות שיש לנתח. כדי למטב את הערכים המספריים במודולים, כוונן את הגדרות הצינור עבור המודולים IdentifyPrimaryObjects"ו- IdentifySecondaryObjects". כדי לעקוב אחר ההתאמות, בחר באפשרות מצב הבדיקה על ידי לחיצה על כפתור התחל מצב בדיקה, או לחילופין, כפתור שלב "בין מודולים A. זה יגרום לחלון קופץ המראה כיצד תמונה תנותח עם הגדרות אלה.
כוונן את ההגדרות לקבלת זיהוי מיטבי. לאחר אופטימיזציה של הצינור, סיים את מצב הבדיקה ובצע את הניתוח על ידי הפעלת מצב בדיקת יציאה "לפני לחיצה על כפתור ניתוח תמונות". לאחר הניתוח, ודא את דיוק זיהוי התא והנקב על ידי השוואת תמונות הקלט עם פלטי שכבת העל שנוצרו על-ידי CellProfiler.
אם זה לא משביע רצון, התאם את הערכים המספריים במודולים השונים עד שתוצאת הניתוח תהיה מדויקת מספיק. טכניקה זו אפשרה את זיהוי התאים מבוסס התוכנה ואת זיהוי פריטין ו- LAMP2. כאשר הפירוק הליזוזומלי של פריטין נחסם על ידי הוספת bafilomycin A1, הקו-לוקליזציה של פריטין אנדוגני ב- LAMP2 גדלה.
העלייה הייתה עקבית עם יכולתו לעכב אנזימי V-ATPase ליזוזומליים החוסמים פריטינופגיה. אימונוסטיין איכותי הוא חובה כדי לנתח תמונות באופן מדויק ואוטומטי, ולכן מומלץ לבצע ניסוי מקדים כדי לבדוק דברים כמו דילול נוגדנים וצפיפויות תאים. ניתן להרחיב פרוטוקול זה לביצוע אנליזה של אור מתאמי ומיקרוסקופ אלקטרונים.
לשם כך ניתן להסיק מסקנות מדויקות, אך סוג השפלת פריטין ליזוזומלי, למשל, באמצעות פריטינופגיה או מסלולים עצמאיים אוטופגיה. אסטרטגיות אלה נבדקות כדי לקבוע אם הן יכולות ללכוד את ההתנהגות התאית הספציפית של תאים שמקורם בחולה BPAN, ואת ההבדל מתאים שבהם. אינו מוטציה.
שיטה זו היא חלק מהתפתחות כזו.
