BPAN의 높은 뇌-철분 축적은 자가포식 단백질의 기능 장애로 인해 발생합니다. 그러나 근본적인 분자 메커니즘은 알려져 있지 않습니다. 이 프로토콜은 페리티노파지(ferritinophagy)와 같은 리소좀 페리틴 분해에 대한 평가를 제공합니다.
이 기법은 단일 세포에서 리소좀 페리틴 분해를 측정하기 위한 정량적 이미지 기반 분석 방법을 제공합니다. 편리하게도, 추가적인 세포 파라미터를 측정하기 위해 적절한 항체 또는 염료를 포함하여 멀티플렉스 접근법을 확장할 수 있습니다. 이 방법은 리소좀 페리틴 분해에 대한 자가포식 의존성 및 독립 경로를 식별하고 구별할 수 있습니다.
세포 수준에서 BPAN의 역기능적인 철분 항상성을 이해하는 데 중요합니다. 박사 과정 학생인 Carmen Pastor-Maldonado는 페리티노파지와 같은 리소좀 페리틴 분해를 분석하는 방법을 시연합니다. 유리 바닥 96웰 플레이트에 장착된 환자 유래 베타 프로펠러 관련 신경 퇴행 세포에서 치료 배지를 흡인하고 Dulbecco의 인산염 완충 식염수(DPBS)로 두 번 세척하여 자가 고정을 시작합니다.
웰당 100마이크로리터의 3.7% 파라포름알데히드(PFA)를 첨가한 후 어둠 속에서 실온에서 20분 동안 세포를 고정합니다. 20분 후 PFA를 제거하고 PBST로 세포를 두 번 세척한 후 섭씨 4도에서 1시간 동안 1% 소 혈청 알부민(BSA)이 포함된 PBST의 세포를 차단합니다. 다음으로, 웰당 PBST로 준비된 1차 항체 혼합물 50마이크로리터를 적용하기 전에 PBST로 세포를 두 번 세척합니다.
플레이트를 파라필름으로 감싸고 섭씨 4도에서 밤새 배양합니다. 다음 날 아침, PBST에서 1:200 비율로 2차 항체 혼합물을 준비합니다. PBST로 세포를 두 번 세척한 후 웰당 50마이크로리터의 갓 준비된 2차 항체 혼합물을 적용합니다.
어둠 속에서 섭씨 4도에서 한 시간 동안 세포를 배양합니다. 다시 말하지만, PBST로 두 번 세척하고 웰당 4'6-디아미디노-2-페닐린돌 또는 DAPI 용액의 갓 준비된 5마이크로그램당 100마이크로리터를 추가하고 플레이트를 배양합니다. 각 웰에 50 마이크로 리터의 PBS를 추가하기 전에 PBS를 두 번 세척 한 다음 어두운 곳에서 4도에서 포장 된 플레이트를 배양합니다.
세포의 자동 이미징을 위해 플레이트의 PBS를 실온에서 50마이크로리터의 새 PBS로 교체합니다. 플레이트를 알루미늄 호일로 덮어 현미경 검사실로 옮깁니다. 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경을 켜고, 현미경 테이블에 96웰 플레이트용 샘플 홀더를 설정하고, 40x 대물렌즈를 선택합니다.
Smart Setup에서 레이저와 필터를 선택하고 최적의 이미지 품질과 속도를 위해 트랙을 할당하여 이미징 설정을 조정합니다. 실험 유형을 선택하려면 "타일"을 클릭하여 선택 옵션을 활성화하고 결정된 XY 위치를 플레이트에 저장합니다. Imaging Setup" 모듈에서 수집 채널, 할당된 트랙, 구동 및 방출 파장을 시각화합니다.
획득 모드" 모듈에서 스캔 속도"를 6으로, 방향을 양방향으로, 평균을 2x로, 픽셀당 비트 수"를 8로 선택합니다. 채널 모듈에서 각 채널의 레이저 출력, 핀홀 및 마스터 게인을 개별적으로 미세 조정하여 과포화 없이 적절하게 노출된 이미지를 얻을 수 있습니다. 그런 다음 Focus Strategy" 모듈을 클릭하고 Combine Software Autofocus and Definite Focus를 선택합니다.
[Reference Channel and Offsets]에서 가장 안정적이고 밝은 채널을 참조로 선택합니다. Stabilization Event Repetitions and Frequency(안정화 이벤트 반복 및 빈도)에서 Standard(표준)를 선택합니다. 소프트웨어 자동 초점 "모듈에서 모드"를 강도로, 검색"을 스마트로, 샘플링을 "미세"및 상대 범위로 선택합니다.
그런 다음 Tiles" 모듈을 클릭합니다. 위치를 단일 위치로 선택합니다. Advanced Setup(고급 설정)에서 플레이트를 탐색하고 이미징할 위치를 식별한 다음 Position Setup(위치 설정)" 탭 아래의 버튼을 클릭합니다.
각 위치에 추가 정보를 표시하려면 속성" 탭을 열고 범주 드롭다운 메뉴 옆에 있는 휠 아이콘을 클릭한 다음 새로 만들기"를 클릭하여 새 대화 상자를 열고 새 범주 이름을 입력합니다. 특정 위치에 카테고리를 할당하려면 위치를 선택하고 속성" 탭을 클릭한 다음 카테고리 드롭다운 메뉴로 이동하여 해당 레이블을 선택합니다. Sample Carrier(샘플 캐리어)에서 Multiwell 96 Cellvis glass bottom 0을 선택합니다.
Calibrate(보정)를 클릭하여 플레이트 표면에 맞게 현미경을 보정합니다. 시스템 사양에 따라 1점 또는 7점 교정 중에서 선택할 수 있습니다. Options(옵션)에서 10%의 Tile Overlap을 선택합니다.Tile Regions의 이동(Travel in Tile Regions)에서 Comb(빗)을 선택하고 Use Stage Speed(스테이지 제어)에서 Stage Speed(스테이지 속도) 사용, Use Stage Acceleration from Stage Control(스테이지 컨트롤에서 스테이지 가속 사용) 및 Image Pyramid During Acquisition(획득 중 이미지 피라미드)을 선택합니다.
완료되면 이미지 획득을 실행하고, 이미지 결과를 CZI 파일로 저장하고, 이미지 메타데이터를 휴대용 하드 드라이브에 CSV 파일로 저장합니다. 이미지를 TIF 파일로 내보냅니다. 위치, 웰, 조건, 시리즈 및 세트 열을 사용하여 고처리량 이미지 분석을 위한 별도의 메타데이터 스프레드시트 파일을 생성합니다.
컨포칼 레이저 스캐닝 현미경 검사에서 가져온 원본 메타데이터 파일에서 적절한 데이터를 검색하고 이 열을 채웁니다. CellProfiler 4.2.4를 두 번 클릭하여 시작하고 드래그 앤 드롭으로 CellProfiler 파이프라인을 가져옵니다. CellProfiler 파이프라인을 적용하기 전에 개별 CZI 이미지 파일 또는 여러 CZI 이미지 파일이 포함된 폴더를 이미지 모듈로 드래그 앤 드롭합니다.
NamesAndTypes" 모듈에서 C1-C3 코드를 소프트웨어가 분석할 단일 채널 이미지를 식별하고 정렬할 수 있는 코드로 바꿉니다. 모듈의 숫자 항목을 최적화하려면 IdentifyPrimaryObjects" 및 IdentifySecondaryObjects" 모듈에 대한 파이프라인 설정을 조정합니다. 조정 사항을 추적하려면 테스트 모드 시작" 버튼을 클릭하거나 모듈 A 사이의 단계" 버튼을 클릭하여 테스트 모드 옵션을 선택합니다. 이렇게 하면 해당 설정으로 이미지를 분석하는 방법을 보여주는 팝업 창이 나타납니다.
최적의 인식을 위해 설정을 미세 조정합니다. 파이프라인이 최적화되면 테스트 모드를 종료하고 이미지 분석" 버튼을 클릭하기 전에 테스트 모드 종료를 활성화하여 분석을 실행합니다. 분석 후에는 입력 영상을 CellProfiler에서 생성된 오버레이 출력값과 비교하여 세포 및 반점 검출 정확도를 확인합니다.
만족스럽지 않으면 분석 결과가 충분히 정확해질 때까지 다른 모듈의 숫자 값을 조정하십시오. 이 기술은 소프트웨어 기반 세포 인식과 페리틴 및 LAMP2 인식을 가능하게 했습니다. 바필로마이신 A1을 첨가하여 페리틴의 리소좀 분해를 차단했을 때, LAMP2에서 내인성 페리틴의 공동 국소화가 증가했습니다.
이러한 증가는 페리티노파지(ferritinophagy)를 차단하는 리소좀 V-ATPase 효소를 억제하는 능력과 일치했습니다. 고품질 면역염색은 이미지를 정확하고 자동으로 분석하기 위해 필수적이므로 항체 희석 및 세포 밀도와 같은 것을 테스트하기 위해 예비 실험을 수행하는 것이 좋습니다. 이 프로토콜은 상관 광 및 전자 현미경 분석을 수행하도록 확장할 수 있습니다.
이를 위해 정확한 결론을 도출할 수 있지만, 예를 들어 페리티노파지(ferritinophage) 또는 자가포식(autophagy-independent pathways)을 통한 리소좀 페리틴 분해 유형을 도출할 수 있습니다. 이러한 전략은 BPAN 환자 유래 세포의 특정 세포 행동을 포착할 수 있는지 여부와 세포와의 차이점을 파악하기 위해 테스트되고 있습니다. 돌연변이되지 않습니다.
이 방법은 그러한 개발의 일부입니다.
