L'elevato accumulo di ferro nel cervello nel BPAN è causato dalla disfunzione della proteina autofagia. Ma i meccanismi molecolari sottostanti sono sconosciuti. Questo protocollo fornisce una valutazione della degradazione della ferritina lisosomiale, come la ferritinofagia.
Questa tecnica offre il metodo di analisi quantitativa basato su immagini per misurare la degradazione della ferritina lisosomiale in singole cellule. L'approccio multiplex può essere esteso includendo anticorpi o coloranti appropriati per misurare parametri cellulari aggiuntivi. Questo metodo è in grado di identificare e differenziare le vie autofagiche dipendenti e indipendenti per la degradazione della ferritina lisosomiale.
È importante per comprendere l'omeostasi disfunzionale del ferro nel BPAN a livello cellulare. La nostra dottoranda, Carmen Pastor-Maldonado, dimostrerà il metodo per analizzare la degradazione della ferritina lisosomiale, come la ferritinofagia. Iniziare l'autofissazione aspirando il terreno di trattamento dalle cellule di neurodegenerazione derivate dal paziente, associate al beta-propulsore, situate in una piastra a 96 pozzetti con fondo di vetro, e lavandole due volte con soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco, o DPBS.
Aggiungere 100 microlitri di paraformaldeide al 3,7%, o PFA, per pozzetto prima di fissare le celle per 20 minuti a temperatura ambiente al buio. Dopo 20 minuti, rimuovere il PFA e lavare le cellule due volte con PBST prima di bloccare le cellule in PBST contenente l'1% di albumina sierica bovina, o BSA, per un'ora a quattro gradi Celsius. Successivamente, lavare le cellule due volte con PBST prima di applicare 50 microlitri della miscela di anticorpi primari preparata in PBST per pozzetto.
Avvolgere le piastre con parafilm e incubare per una notte a quattro gradi Celsius. La mattina seguente, preparare la miscela di anticorpi secondari in PBST in un rapporto di uno a 200. Dopo aver lavato le cellule due volte con PBST, applicare 50 microlitri della miscela di anticorpi secondari appena preparata per pozzetto.
Incubare le cellule a quattro gradi Celsius per un'ora al buio. Ancora una volta, fare due lavaggi con PBST e aggiungere 100 microlitri di soluzione per pozzetto di cinque microgrammi per microlitro di 4'6-diamidino-2-fenilidolo, o DAPI, preparata al momento e incubare la piastra. Somministrare due lavaggi PBS prima di aggiungere 50 microlitri di PBS a ciascun pozzetto, quindi incubare le piastre avvolte a quattro gradi al buio.
Per l'imaging automatizzato delle cellule, sostituire il PBS nella piastra con 50 microlitri di PBS fresco a temperatura ambiente. Coprire la piastra con un foglio di alluminio per trasferirla nella sala di microscopia. Accendere il microscopio confocale a scansione laser, posizionare un portacampioni per piastre da 96 pozzetti sul tavolo del microscopio e selezionare un obiettivo 40x.
Regola le impostazioni di imaging selezionando i laser e i filtri in Smart Setup e assegnando le tracce per una qualità e una velocità dell'immagine ottimali. Per selezionare il tipo di esperimento, fare clic su Piastrelle"per abilitare l'opzione di selezione e salvare le posizioni XY determinate sulla piastra. Nel modulo "Imaging Setup", visualizzare i canali di acquisizione, le tracce assegnate e le relative lunghezze d'onda di eccitazione ed emissione.
Nel modulo Modalità di acquisizione, selezionare Velocità di scansione"come sei, Direzione"come bidirezionale, Media"come 2x e Bit per pixel"come otto. Nel modulo canali, regolate con precisione la potenza del laser, il foro stenopeico e il guadagno master per ciascun canale individualmente per ottenere immagini correttamente esposte senza saturarle eccessivamente. Quindi, fai clic sul modulo Strategia di messa a fuoco" e seleziona Combina autofocus software e messa a fuoco definita.
In Canale di riferimento e offset, selezionare il canale più stabile e luminoso come riferimento. In Ripetizioni e frequenza degli eventi di stabilizzazione, selezionare Standard. Nel modulo Software Autofocus, selezionare Modalità"come Intensità, Ricerca"come Intelligente, Campionamento"come Fine" e Gamma relativa.
Quindi, fai clic sul modulo Riquadri". Seleziona le posizioni come Posizioni singole. In Configurazione avanzata, navigare tra la piastra, identificare una posizione per l'imaging e fare clic sul pulsante nella scheda Impostazione posizione.
Per etichettare ogni posizione con informazioni aggiuntive, apri la scheda Proprietà"e fai clic sull'icona della rotellina accanto al menu a discesa della categoria, quindi fai clic su Nuovo"per aprire una nuova finestra di dialogo per inserire un nuovo nome di categoria. Per assegnare una categoria a una determinata posizione, selezionare la posizione, fare clic sulla scheda Proprietà, andare al menu a discesa delle categorie e selezionare l'etichetta corrispondente. In Sample Carrier, selezionare Multiwell 96 Cellvis glass bottom 0.
Fare clic su Calibra"per calibrare il microscopio sulla superficie della piastra. È possibile scegliere tra la calibrazione a un punto o a sette punti a seconda delle specifiche del sistema. In Opzioni, seleziona una sovrapposizione di tessere del 10%In Viaggio nelle regioni delle tessere, seleziona Pettina"e seleziona Usa velocità fase da Stage Control, Usa accelerazione stage da Stage Control" e Piramide immagine durante l'acquisizione.
Al termine, eseguire l'acquisizione dell'immagine, salvare i risultati dell'immagine come file CZI e i metadati dell'immagine come file CSV su un disco rigido portatile. Esporta le immagini come file TIF. Crea un file di foglio di calcolo dei metadati separato per l'analisi delle immagini ad alto rendimento con le colonne posizione, pozzetto, condizione, serie e set.
Recupera i dati appropriati dal file di metadati originale proveniente dalla microscopia a scansione laser confocale e riempi queste colonne. Avviare CellProfiler 4.2.4 facendo doppio clic e importare la pipeline di CellProfiler mediante trascinamento della selezione. Prima di adattare la pipeline di CellProfiler, trascinare i singoli file immagine CZI o una cartella contenente più file immagine CZI nel modulo immagine.
Nel modulo NamesAndTypes, sostituire il codice C1-C3 con un codice che permetta al software di identificare e ordinare le immagini a canale singolo da analizzare. Per ottimizzare le voci numeriche nei moduli, ottimizzare le impostazioni della pipeline per i moduli IdentifyPrimaryObjects e IdentifySecondaryObjects. Per tenere traccia delle regolazioni, selezionare l'opzione della modalità di test facendo clic sul pulsante Avvia modalità di test o, in alternativa, sul pulsante Step" tra i moduli A. Ciò si tradurrà in una finestra pop-up che mostra come un'immagine verrebbe analizzata con tali impostazioni.
Ottimizza le impostazioni per un riconoscimento ottimale. Una volta ottimizzata la pipeline, terminare la modalità di test ed eseguire l'analisi attivando il pulsante Esci dalla modalità di test" prima di fare clic sul pulsante Analizza immagini". Dopo l'analisi, verificare l'accuratezza del rilevamento di celle e punti confrontando le immagini di input con gli output di sovrapposizione generati da CellProfiler.
Se non è soddisfacente, regolare i valori numerici nei diversi moduli fino a quando il risultato dell'analisi non è sufficientemente accurato. Questa tecnica ha reso possibile il riconoscimento cellulare basato su software e il riconoscimento di ferritina e LAMP2. Quando la degradazione lisosomiale della ferritina è stata bloccata dall'aggiunta di bafilomicina A1, la co-localizzazione della ferritina endogena in LAMP2 è aumentata.
L'aumento era coerente con la sua capacità di inibire gli enzimi lisosomiale V-ATPasi che bloccano la ferritinofagia. L'immunocolorazione di alta qualità è obbligatoria per analizzare le immagini in modo accurato e automatico, quindi è consigliabile condurre un esperimento preliminare per testare cose come le diluizioni degli anticorpi e la densità cellulare. Questo protocollo può essere esteso per eseguire analisi correlate al microscopio ottico ed elettronico.
Per questo, si possono trarre conclusioni precise, ma il tipo di degradazione della ferritina lisosomiale, ad esempio, attraverso la ferritinofagia o vie indipendenti dall'autofagia. Queste strategie sono in fase di test per determinare se sono in grado di catturare il comportamento cellulare specifico delle cellule derivate da pazienti con BPAN e la differenza dalle cellule in cui si trovano. Non è mutato.
Questo metodo fa parte di tale sviluppo.
