O alto acúmulo de ferro no cérebro no BPAN é causado pela disfunção da proteína da autofagia. Mas os mecanismos moleculares subjacentes são desconhecidos. Este protocolo fornece uma avaliação da degradação da ferritina lisossômica, como a ferritinofagia.
Esta técnica oferece o método de análise quantitativa baseado em imagem para medir a degradação da ferritina lisossômica em células individuais. Convenientemente, a abordagem multiplex pode ser estendida incluindo anticorpos ou corantes apropriados para medir parâmetros celulares adicionais. Este método pode identificar e diferenciar vias dependentes e independentes de autofagia para degradação da ferritina lisossômica.
É importante para entender a homeostase disfuncional do ferro no BPAN no nível celular. Nossa aluna de doutorado, Carmen Pastor-Maldonado, demonstrará o método para analisar a degradação da ferritina lisossômica, como a ferritinofagia. Comece a autofixação aspirando o meio de tratamento das células de neurodegeneração associadas à hélice beta derivadas do paciente assentadas em uma placa de 96 poços com fundo de vidro e lavando-as duas vezes com solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco, ou DPBS.
Adicione 100 microlitros de 3,7% de paraformaldeído, ou PFA, por poço antes de fixar as células por 20 minutos em temperatura ambiente no escuro. Após 20 minutos, remova o PFA e lave as células duas vezes com PBST antes de bloquear as células em PBST contendo 1% de albumina de soro bovino, ou BSA, por uma hora a quatro graus Celsius. Em seguida, lave as células duas vezes com PBST antes de aplicar 50 microlitros da mistura de anticorpos primários preparada em PBST por poço.
Embrulhe as placas com parafilme e incube durante a noite a quatro graus Celsius. Na manhã seguinte, prepare a mistura de anticorpos secundários em PBST na proporção de um para 200. Depois de lavar as células duas vezes com PBST, aplique 50 microlitros da mistura de anticorpos secundários recém-preparada por poço.
Incube as células a quatro graus Celsius por uma hora no escuro. Novamente, dê duas lavagens com PBST e adicione 100 microlitros de cinco microgramas por microlitros recém-preparados de solução de 4'6-diamidino-2-fenilindol, ou DAPI, por poço e incube a placa. Faça duas lavagens de PBS antes de adicionar 50 microlitros de PBS a cada poço e, em seguida, incube as placas embrulhadas a quatro graus no escuro.
Para imagens automatizadas das células, substitua o PBS na placa por 50 microlitros de PBS fresco à temperatura ambiente. Cubra a placa com papel alumínio para transferi-la para a sala de microscopia. Ligue o microscópio confocal de varredura a laser, defina um suporte de amostra para placas de 96 poços na mesa do microscópio e selecione uma objetiva de 40x.
Ajuste as configurações de imagem selecionando os lasers e filtros no Smart Setup e atribuindo as trilhas para obter qualidade e velocidade de imagem ideais. Para selecionar o tipo de experimento, clique em Tiles"para habilitar a opção de seleção e salvar as posições XY determinadas na placa. No módulo Configuração de imagem, visualize os canais de aquisição, as trilhas atribuídas e seus comprimentos de onda de excitação e emissão.
No módulo Modo de aquisição, selecione Velocidade de varredura "como seis", Direção "como bidirecional, Média" como 2x e Bits por pixel "como oito. No módulo de canais, ajuste a potência do laser, o orifício e o ganho principal de cada canal individualmente para obter imagens expostas adequadamente sem saturá-las demais. Em seguida, clique no módulo Estratégia de foco" e selecione Combinar foco automático de software e foco definido.
Em Canal de referência e deslocamentos, selecione o canal mais estável e mais brilhante como referência. Em Repetições e frequência de eventos de estabilização, selecione Padrão. No módulo Foco automático do software, selecione Modo"como Intensidade, Pesquisa"como Inteligente, Amostragem"como Fino"e Alcance Relativo.
Em seguida, clique no módulo Tiles". Selecione as posições como Posições Únicas. Em Configuração avançada, navegue pela placa, identifique uma posição para imagem e clique no botão na guia Configuração de posição.
Para rotular cada posição com informações adicionais, abra o Propriedades"guia e clique no ícone de roda ao lado do menu suspenso da categoria e, em seguida, clique em Novo"para abrir uma nova caixa de diálogo para inserir um novo nome de categoria. Para atribuir uma categoria a uma determinada posição, selecione a posição, clique no botão Propriedades"guia, vá para o menu suspenso de categorias e selecione o rótulo correspondente. Em Sample Carrier, selecione Multiwell 96 Cellvis fundo de vidro 0.
Clique em Calibrar" para calibrar o microscópio para a superfície da placa. Escolha entre calibração de um ou sete pontos, dependendo das especificações do sistema. Em Opções, selecione uma sobreposição de bloco de 10%Em Viagem em regiões de bloco, selecione Pente "e marque Usar velocidade do estágio do controle do estágio, Usar aceleração do estágio do controle do estágio" e Pirâmide de imagens durante a aquisição.
Uma vez feito isso, execute a aquisição de imagem, salve os resultados da imagem como arquivo CZI e os metadados da imagem como arquivos CSV em um disco rígido portátil. Exporte as imagens como arquivos TIF. Crie um arquivo de planilha de metadados separado para análise de imagem de alto rendimento com as colunas position, well, condition, series e set.
Recupere os dados apropriados do arquivo de metadados original proveniente da microscopia confocal de varredura a laser e preencha essas colunas. Inicie o CellProfiler 4.2.4 clicando duas vezes e importe o pipeline do CellProfiler arrastando e soltando. Antes de adaptar o pipeline do CellProfiler, arraste e solte arquivos de imagem CZI individuais ou uma pasta contendo vários arquivos de imagem CZI no módulo de imagem.
No módulo NamesAndTypes", substitua o código C1-C3 por um código que permita ao software identificar e classificar as imagens de canal único a serem analisadas. Para otimizar as entradas numéricas nos módulos, ajuste as configurações de pipeline para os módulos IdentifyPrimaryObjects"e IdentifySecondaryObjects". Para acompanhar os ajustes, selecione a opção de modo de teste clicando no botão "Iniciar modo de teste" ou, alternativamente, no botão Etapa" entre os módulos A. Isso resultará em uma janela pop-up mostrando como uma imagem seria analisada com essas configurações.
Ajuste as configurações para um reconhecimento ideal. Assim que o pipeline estiver otimizado, encerre o modo de teste e execute a análise ativando o Sair do modo de teste"antes de clicar no botão Analisar imagens"botão. Após a análise, verifique a precisão da detecção de células e pontos comparando as imagens de entrada com as saídas de sobreposição geradas pelo CellProfiler.
Se não for satisfatório, ajustar os valores numéricos nos diferentes módulos até que o resultado da análise seja suficientemente preciso. Essa técnica possibilitou o reconhecimento celular baseado em software e o reconhecimento de ferritina e LAMP2. Quando a degradação lisossômica da ferritina foi bloqueada pela adição de bafilomicina A1, a co-localização da ferritina endógena em LAMP2 aumentou.
O aumento foi consistente com sua capacidade de inibir as enzimas lisossômicas V-ATPase que bloqueiam a ferritinofagia. A imunocoloração de alta qualidade é obrigatória para analisar as imagens com precisão e automaticamente, portanto, é aconselhável realizar experimentos preliminares para testar coisas como diluições de anticorpos e densidades celulares. Este protocolo pode ser estendido para realizar análises correlativas de luz e microscopia eletrônica.
Para isso, conclusões precisas podem ser tiradas, mas o tipo de degradação da ferritina lisossômica, por exemplo, via ferritinofagia ou vias independentes de autofagia. Essas estratégias estão sendo testadas para determinar se podem capturar o comportamento celular específico das células derivadas do paciente BPAN e a diferença das células onde. Não é mutado.
Este método faz parte desse desenvolvimento.
