BPANにおける脳鉄の蓄積が高いのは、オートファジータンパク質の機能不全が原因です。しかし、その根底にある分子メカニズムは不明です。このプロトコルは、フェリチノファジーなどのリソソームフェリチン分解の評価を提供します。
この手法は、単一細胞におけるリソソームフェリチンの分解を測定するための定量的な画像ベースの分析方法を提供します。便利なことに、マルチプレックスアプローチは、追加の細胞パラメータを測定するための適切な抗体または色素を含めることで拡張できます。この方法により、リソソームフェリチン分解のオートファジー依存性経路と非依存性経路を特定し、区別することができます。
BPANにおける機能不全の鉄恒常性を細胞レベルで理解するために重要です。私たちの博士課程の学生、Carmen Pastor-Maldonadoは、フェリチノファジーなどのリソソームフェリチン分解を分析する方法を示します。ガラス底の96ウェルプレートに座っている患者由来のベータプロペラ関連神経変性細胞から治療培地を吸引し、ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)で2回洗浄することにより、自己固定を開始します。
ウェルあたり100マイクロリットルの3.7%パラホルムアルデヒド(PFA)を添加してから、暗闇の中で室温で20分間細胞を固定します。20分後、PFAを除去し、PBSTで細胞を2回洗浄してから、1%ウシ血清アルブミン(BSA)を含むPBSTで細胞を摂氏4度で1時間ブロックします。次に、PBSTで調製した一次抗体ミックスをウェルごとに50マイクロリットル適用する前に、PBSTで細胞を2回洗浄します。
プレートをパラフィルムで包み、摂氏4度で一晩インキュベートします。翌朝、二次抗体ミックスをPBSTで1対200の比率で調製します。PBSTで細胞を2回洗浄した後、調製したばかりの二次抗体ミックスをウェルあたり50μLにインプします。
細胞を摂氏4度で暗所で1時間インキュベートします。再度、PBSTで2回の洗浄を行い、ウェルごとに新たに調製した5マイクログラム/マイクロリットルの4'6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)溶液を100マイクロリットル加え、プレートをインキュベートします。各ウェルに50マイクロリットルのPBSを追加する前に、2回のPBS洗浄を行い、次に、暗所で4度でラップしたプレートをインキュベートします。
細胞の自動イメージングのために、プレート内のPBSを室温で50マイクロリットルの新鮮なPBSと交換します。プレートをアルミホイルで覆い、顕微鏡室に移します。共焦点レーザー走査型顕微鏡の電源を入れ、顕微鏡テーブルに96ウェルプレート用のサンプルホルダーをセットし、40倍対物レンズを選択します。
Smart Setupでレーザーとフィルターを選択し、最適な画質と速度でトラックを割り当てて、イメージング設定を調整します。実験の種類を選択するには、「タイル」をクリックして選択オプションを有効にし、プレート上の決定されたXY位置を保存します。「イメージングセットアップ」モジュールで、取得チャンネル、割り当てられたトラック、およびそれらの励起波長と発光波長を視覚化します。
「Acquisition Mode」モジュールで、「Scan Speed」を6、「Direction」を双方向、「Averaging」を2x、「Bits per Pixel」を8として選択します。チャンネルモジュールでは、各チャンネルのレーザー出力、ピンホール、マスターゲインを個別に微調整して、画像を過度に飽和させることなく適切に露出した画像を実現します。次に、「Focus Strategy」モジュールをクリックし、「Combine Software Autofocus」と「Definite Focus」を選択します。
[Reference Channel and Offsets] で、最も安定していて最も明るいチャンネルを参照として選択します。安定化イベントの繰り返しと頻度(Stabilization Event Repetitions and Frequency)で、標準(Standard)を選択します。「ソフトウェアオートフォーカス」モジュールで、「モード」を強度、「検索」をスマート、「サンプリング」を「ファイン」、相対範囲を選択します。
次に、Tiles」モジュールをクリックします。ポジションを [シングル ポジション] として選択します。[Advanced Setup]で、プレート内を移動し、イメージングの位置を特定し、[Position Setup]タブの下のボタンをクリックします。
各ポジションに追加情報でラベルを付けるには、[プロパティ]タブを開き、カテゴリドロップダウンメニューの横にあるホイールアイコンをクリックしてから、[新規]をクリックして新しいダイアログボックスを開き、新しいカテゴリ名を入力します。特定のポジションにカテゴリを割り当てるには、ポジションを選択し、[プロパティ]タブをクリックし、カテゴリのドロップダウンメニューに移動して、対応するラベルを選択します。[サンプルキャリア]で、[Multiwell 96 Cellvis]ガラス底部0を選択します。
「キャリブレーション」をクリックして、顕微鏡をプレート表面にキャリブレーションします。システムの仕様に応じて、1ポイントまたは7ポイントのキャリブレーションを選択します。[オプション] で、タイルの重なりを 10% に選択し、[タイル領域の移動] で [コーム] を選択し、[ステージ コントロールからステージ速度を使用]、[ステージ コントロールからステージ アクセラレーションを使用]、および [取得中にイメージ ピラミッド] をオンにします。
完了したら、画像取得を実行し、画像結果をCZIファイルとして保存し、画像メタデータをCSVファイルとしてポータブルハードドライブに保存します。画像をTIFファイルとしてエクスポートします。ハイスループットの画像解析のために、位置、ウェル、条件、シリーズ、およびセットの列を含む別のメタデータ スプレッドシート ファイルを作成します。
NamesAndTypes"モジュールで、C1-C3コードを、ソフトウェアが分析するシングルチャネル画像を識別して並べ替えることができるコードに置き換えます。モジュール内の数値エントリを最適化するには、IdentifyPrimaryObjects"モジュールとIdentifySecondaryObjects"モジュールのパイプライン設定を調整します。調整を追跡するには、「テストモードの開始」ボタンをクリックしてテストモードオプションを選択します。または、モジュールA間の「ステップ」ボタンをクリックすると、これらの設定で画像がどのように分析されるかを示すポップアップウィンドウが表示されます。
最適な認識のために設定を微調整します。パイプラインが最適化されたら、テストモードを終了し、Exit Test Modeをアクティブにして分析を実行します。その後、[Analyze Images]ボタンをクリックします。解析後、入力画像とCellProfilerによって生成されたオーバーレイ出力を比較することにより、セルとプンクタの検出精度を確認します。
満足できない場合は、解析結果が十分に正確になるまで、さまざまなモジュールの数値を調整します。この技術により、ソフトウェアベースの細胞認識とフェリチンおよびLAMP2認識が可能になりました。バフィロマイシンA1を添加することでフェリチンのリソソーム分解を阻害すると、LAMP2における内因性フェリチンの共局在が増加した。
この増加は、フェリチノファジーをブロックするリソソームV-ATPase酵素を阻害する能力と一致していました。画像を正確かつ自動的に解析するためには、高品質な免疫染色が必須であるため、抗体の希釈や細胞密度などを調べるための予備実験を行うことが推奨されます。このプロトコルは、光顕微鏡と電子顕微鏡の相関分析を実行するように拡張できます。
このためには、正確な結論を導き出すことができますが、リソソームフェリチン分解の種類は、例えば、フェリチノファジーまたはオートファジー非依存性経路を介して行われます。これらの戦略は、BPAN患者由来細胞の特定の細胞挙動を捕捉できるかどうか、および細胞との違いを捕捉できるかどうかを判断するためにテストされています。変異しません。
この手法もその一環です。
