Высокое накопление железа в мозге в БПАН вызвано дисфункцией белка аутофагии. Но лежащие в основе молекулярные механизмы неизвестны. Этот протокол обеспечивает оценку лизосомальной деградации ферритина, такой как ферритинофагия.
Этот метод предлагает метод количественного анализа на основе изображений для измерения лизосомальной деградации ферритина в отдельных клетках. Удобно то, что мультиплексный подход может быть расширен за счет включения соответствующих антител или красителей для измерения дополнительных клеточных параметров. Этот метод позволяет идентифицировать и дифференцировать зависимые от аутофагии и независимые пути лизосомальной деградации ферритина.
Это важно для понимания дисфункционального гомеостаза железа при БПАН на клеточном уровне. Наш аспирант Кармен Пастор-Мальдонадо продемонстрирует метод анализа лизосомальной деградации ферритина, такой как ферритинофагия. Начните самофиксацию с аспирации лечебной среды из полученных пациентом бета-пропеллер-ассоциированных нейродегенеративных клеток, помещенных в 96-луночный планшет со стеклянным дном, и промывайте их два раза фосфатно-солевым буфером Дульбекко, или DPBS.
Добавьте 100 микролитров 3,7% параформальдегида, или PFA, в лунку перед фиксацией клеток на 20 минут при комнатной температуре в темноте. Через 20 минут удалите PFA и промойте клетки два раза PBST, прежде чем блокировать клетки PBST, содержащим 1% бычьего сывороточного альбумина, или BSA, в течение одного часа при четырех градусах Цельсия. Далее дважды промойте клетки PBST перед применением 50 микролитров первичной смеси антител, приготовленной в PBST, на лунку.
Оберните тарелки парапленкой, и выдерживайте в течение ночи при температуре четыре градуса Цельсия. На следующее утро приготовьте вторичную смесь антител в PBST в соотношении один к 200. После двукратной промывки клеток PBST нанесите 50 микролитров свежеприготовленной вторичной смеси антител на лунку.
Инкубируйте клетки при температуре четыре градуса Цельсия в течение одного часа в темноте. Снова сделайте два промывки PBST и добавьте 100 микролитров свежеприготовленного раствора 4'6-диамидино-2-фенилиндола, или DAPI, в одну лунку и инкубируйте тарелку. Сделайте две промывки PBS, прежде чем добавить по 50 микролитров PBS в каждую лунку, затем выдержите завернутые тарелки при температуре четыре градуса в темноте.
Для автоматизированной визуализации клеток замените PBS в планшете на 50 микролитров свежего PBS комнатной температуры. Накройте пластину алюминиевой фольгой, чтобы перенести ее в кабинет микроскопии. Включите конфокальный лазерный сканирующий микроскоп, установите на стол микроскопа держатель образца для 96-луночных планшетов и выберите объектив с 40-кратным увеличением.
Отрегулируйте параметры изображения, выбрав лазеры и фильтры в Smart Setup и назначив дорожки для оптимального качества и скорости изображения. Чтобы выбрать тип эксперимента, нажмите на «Плитки», чтобы включить опцию выбора и сохранить определенные положения XY на пластине. В модуле «Настройка обработки изображений» визуализируйте каналы захвата, назначенные треки, а также длины волн их возбуждения и излучения.
В модуле «Режим сбора» выберите «Скорость сканирования» как шесть, «Направление» как двунаправленное, «Усреднение» как 2x и «Бит на пиксель» как восемь. В модуле каналов можно точно настроить мощность лазера, точечное отверстие и коэффициент усиления для каждого канала по отдельности, чтобы получить правильно экспонированные изображения без их перенасыщения. Далее нажмите на модуль «Стратегия фокусировки» и выберите «Объединить программный автофокус и определенный фокус».
В разделе Опорный канал и смещения выберите наиболее стабильный и яркий канал в качестве опорного. В разделе Повторения событий стабилизации и частота выберите Стандартный. В модуле «Программный автофокус» выберите «Режим» как «Интенсивность», «Поиск» как «Умный», «Выборка» как «Тонкий» и «Относительный диапазон».
Далее кликаем на модуль "Плитки". Выберите позиции в качестве одиночных позиций. В разделе «Расширенная настройка» перейдите по пластине, определите положение для визуализации и нажмите кнопку на вкладке «Настройка позиции».
Чтобы пометить каждую позицию дополнительной информацией, откройте вкладку «Свойства» и нажмите на значок колеса рядом с выпадающим меню категории, затем нажмите «Создать», чтобы открыть новое диалоговое окно для ввода нового названия категории. Чтобы присвоить категорию определенной позиции, выберите позицию, перейдите на вкладку «Свойства», перейдите в выпадающее меню категорий и выберите соответствующую метку. В разделе Sample Carrier (Держатель образца) выберите Multiwell 96 Cellvis glass bottom 0.
Нажмите «Калибровать», чтобы откалибровать микроскоп по поверхности пластины. Выберите одноточечную или семиточечную калибровку в зависимости от технических характеристик системы. В разделе «Параметры» выберите перекрытие плитки на 10%В разделе «Перемещение по областям мозаики» выберите «Гребень» и отметьте галочками «Использовать скорость рабочей области из Stage Control», «Использовать ускорение рабочей области из Stage Control» и «Пирамида изображений во время съемки».
После этого запустите сбор изображений, сохраните результаты изображения в виде файла CZI, а метаданные изображения в виде файлов CSV на портативном жестком диске. Экспортируйте изображения в виде файлов TIF. Создайте отдельный файл метаданных электронной таблицы для высокопроизводительного анализа изображений с указанием столбцов position, well, condition, series и set.
Извлеките соответствующие данные из исходного файла метаданных, полученного в результате конфокальной лазерной сканирующей микроскопии, и заполните эти столбцы. Запустите CellProfiler 4.2.4, дважды щелкнув мышью, и импортируйте конвейер CellProfiler путем перетаскивания. Перед адаптацией конвейера CellProfiler перетащите отдельные файлы образов CZI или папку, содержащую несколько файлов образов CZI, в модуль образов.
В модуле NamesAndTypes" замените код C1-C3 на код, который позволяет программному обеспечению идентифицировать и сортировать одноканальные изображения для анализа. Чтобы оптимизировать числовые записи в модулях, настройте параметры конвейера для модулей IdentifyPrimaryObjects"и IdentifySecondaryObjects. Чтобы отслеживать корректировки, выберите опцию тестового режима, нажав кнопку «Начать тестовый режим» или, в качестве альтернативы, кнопку «Шаг» между модулями A. В результате появится всплывающее окно, показывающее, как изображение будет проанализировано с этими настройками.
Тонкая настройка параметров для оптимального распознавания. После того, как конвейер будет оптимизирован, завершите тестовый режим и выполните анализ, активировав режим выхода из тестового режима перед нажатием кнопки «Анализировать изображения». После анализа проверьте точность обнаружения ячеек и точек, сравнив входные изображения с оверлейными выходными данными, созданными CellProfiler.
Если результаты неудовлетворительны, отрегулируйте числовые значения в различных модулях до тех пор, пока результат анализа не станет достаточно точным. Этот метод сделал возможным программное распознавание клеток, а также распознавание ферритина и LAMP2. Когда лизосомальная деградация ферритина блокировалась добавлением бафиломицина А1, колокализация эндогенного ферритина в LAMP2 увеличивалась.
Увеличение согласуется с его способностью ингибировать ферменты лизосомальную V-АТФазу, блокирующие ферритинофагию. Высококачественное иммуноокрашивание является обязательным для точного и автоматического анализа изображений, поэтому рекомендуется провести предварительный эксперимент для проверки таких вещей, как разведение антител и плотность клеток. Этот протокол может быть расширен для выполнения корреляционного светового и электронного микроскопического анализа.
Для этого можно сделать точные выводы, но о типе лизосомальной деградации ферритина, например, через ферритинофагию или аутофагии-независимые пути. Эти стратегии тестируются, чтобы определить, могут ли они улавливать специфическое клеточное поведение клеток, полученных от пациентов с BPAN, и разницу от клеток, где они находятся. Не мутирует.
Данный метод является частью такого развития.
