BPAN 中的高脑铁积累是由自噬蛋白功能障碍引起的。但潜在的分子机制尚不清楚。该方案提供了溶酶体铁蛋白降解的评估，例如铁蛋白自噬。
该技术提供了一种基于图像的定量分析方法来测量单细胞中的溶酶体铁蛋白降解。方便的是，可以通过加入适当的抗体或染料来扩展多重方法，以测量其他细胞参数。该方法可以识别和区分溶酶体铁蛋白降解的自噬依赖性和非依赖性途径。
这对于在细胞水平上了解 BPAN 中功能失调的铁稳态很重要。我们的博士生 Carmen Pastor-Maldonado 将演示分析溶酶体铁蛋白降解的方法，例如铁蛋白自噬。通过从位于玻璃底 96 孔板中的患者来源的 β 螺旋桨相关神经变性细胞中吸出治疗培养基，并用 Dulbecco 磷酸盐缓冲盐水或 DPBS 洗涤它们两次来开始自固定。
每孔加入 100 μL 3.7% 多聚甲醛或 PFA，然后在室温下在黑暗中固定细胞 20 分钟。20 分钟后，去除 PFA 并用 PBST 洗涤细胞两次，然后在含有 1% 牛血清白蛋白 （BSA） 的 PBST 中封闭细胞，在 4 摄氏度下封闭 1 小时。接下来，用 PBST 洗涤细胞两次，然后每孔施用 50 μL 在 PBST 中制备的一抗混合物。
用封口膜包裹板，并在 4 摄氏度下孵育过夜。第二天早上，在 PBST 中以 1：200 的比例制备二抗混合物。用 PBST 洗涤细胞两次后，每孔涂抹 50 μL 新鲜制备的二抗混合物。
将细胞在 4 摄氏度下避光孵育 1 小时。同样，用 PBST 洗涤两次，每孔加入 100 微升新鲜制备的 5 微克 4'6-二脒基-2-苯基吲哚或 DAPI 溶液，然后孵育板。在向每个孔中加入 50 微升 PBS 之前，进行两次 PBS 洗涤，然后将包装好的板在 4 度下避光孵育。
对于细胞的自动成像，在室温下用 50 微升新鲜 PBS 替换板中的 PBS。用铝箔盖住板，将其转移到显微镜室。打开共聚焦激光扫描显微镜，在显微镜台上为 96 孔板设置样品架，然后选择 40 倍物镜。
通过在 Smart Setup 中选择激光器和滤镜来调整成像设置，并分配轨道以获得最佳图像质量和速度。要选择实验类型，请单击 Tiles“以启用选择选项并保存确定的 XY 位置在板上。在 Imaging Setup“模块中，可视化采集通道、分配的轨迹及其激发和发射波长。
在采集模式“模块中，选择”扫描速度“为 6，方向”为双向“，平均”为 2x，每像素位数“为 8。在 channels 模块中，单独微调每个通道的激光功率、针孔和主增益，以获得正确曝光的图像，而不会使图像过度饱和。接下来，点击 Focus Strategy（聚焦策略）模块，选择 Combine Software Autofocus （结合软件自动对焦） 和 Definite Focus（定焦）。
在 Reference Channel and Offsets 下，选择最稳定、最亮的通道作为参考。在 Stabilization Event Repetitions and Frequency （稳定事件重复次数和频率） 下，选择 Standard （标准）。在软件自动对焦“模块中，选择模式”作为强度“，搜索”智能“，采样”作为精细“和相对范围。
接下来，单击 Tiles“模块。选择位置作为 Single Positions。在“高级设置”下，浏览板，确定成像位置，然后单击“位置设置”选项卡下的按钮。
要使用其他信息标记每个位置，请打开 属性 选项卡，然后单击类别下拉菜单旁边的滚轮图标，然后单击 新建 打开一个新对话框以输入新的类别名称。要将类别分配给特定位置，请选择该位置，单击 属性“选项卡，转到类别下拉菜单并选择相应的标签。在“样品载体”下，选择 Multiwell 96 Cellvis glass bottom 0。
单击“校准”将显微镜校准到板表面。根据系统的规格，在单点或七点校准之间进行选择。在“选项”下，选择 10% 的平铺重叠在“平铺区域中的行程”下，选择“梳理”并勾选“使用舞台控制中的舞台速度”、“使用舞台控制中的舞台加速度”和“采集期间的图像棱锥”。
完成后，运行图像采集，将图像结果保存为 CZI 文件，并将图像元数据保存为便携式硬盘上的 CSV 文件。将图像导出为 TIF 文件。使用位置、孔、条件、系列和设置列创建单独的元数据电子表格文件，用于高通量图像分析。
从来自共聚焦激光扫描显微镜的原始元数据文件中检索适当的数据，并填充这些列。双击启动 CellProfiler 4.2.4，然后通过拖放导入 CellProfiler 管道。在调整 CellProfiler 管道之前，将单个 CZI 图像文件或包含多个 CZI 图像文件的文件夹拖放到图像模块中。
在 NamesAndTypes“模块中，将 C1-C3 代码替换为允许软件识别和排序要分析的单通道图像的代码。要优化模块中的数字条目，请调整 IdentifyPrimaryObjects“和 IdentifySecondaryObjects”模块的管道设置。要跟踪调整，请单击 Start Test Mode“按钮来选择测试模式选项，或者单击模块之间的 Step”按钮 A.这将导致一个弹出窗口，显示如何使用这些设置分析图像。
微调设置以获得最佳识别。优化管道后，结束测试模式并通过激活 Exit Test Mode（退出测试模式）来执行分析，然后单击 Analyze Images（分析图像）按钮。分析后，通过将输入图像与 CellProfiler 生成的叠加输出进行比较来验证细胞和点检测的准确性。
如果不满意，请调整不同模块中的数值，直到分析结果足够准确。该技术使基于软件的细胞识别以及铁蛋白和 LAMP2 识别成为可能。当通过添加巴弗洛霉素 A1 阻断铁蛋白的溶酶体降解时，LAMP2 中内源性铁蛋白的共定位增加。
这种增加与其抑制阻断铁蛋白自噬的溶酶体 V-ATP 酶的能力一致。高质量的免疫染色对于准确和自动地分析图像是必要的，因此建议进行初步实验以测试抗体稀释度和细胞密度等内容。该协议可以扩展为执行相关的光学和电子显微镜分析。
为此，可以得出精确的结论，但溶酶体铁蛋白降解的类型，例如，通过铁自噬或不依赖自噬的途径。这些策略正在接受测试，以确定它们是否能够捕获 BPAN 患者来源的细胞的特定细胞行为，以及与细胞的差异。未发生突变。
这种方法是此类开发的一部分。
