الهدف العام من هذه الدراسة هو تطوير منصة زرع عبر الصلبة مع توجيه مباشر عبر الحدقة لتسهيل توصيل الخلايا تحت الشبكية في متلقي الفئران. تم إجراء جميع التجارب على وفقا لدليل المعهد الوطني للصحة. بياننا عن استخدام ووافقت عليه لجنة رعاية واستخدام بجامعة جونز هوبكنز.
تم استخدام اعتماد عمر الفئران EGFP في يوم ما بعد الولادة 3-6 كمتبرعين بمعلقات خلايا الشبكية. تم اعتماد الفئران OPN1LW-EGFP / NRL ، العمر في اليوم 3 بعد الولادة كمتبرعين بورقة الشبكية. تم استخدام الفئران التنكس الشبكي البالغ Rd1 / NS مع نقص المناعة كمتلقين.
القتل الرحيم للفئران المانحة بجرعة زائدة من ثاني أكسيد الكربون. لعزل مقل عيون الفئران ، افتح جفون الجراء بعناية باستخدام مقص صغير وفضح مقلة العين. لف العصب البصري ، واسحب مقلة العين بالملقط الناعم.
بمجرد عزل مقل العيون ، قم بشق ثقب في وسط القرنية باستخدام إبرة قياس 25. قطع القرنية إلى النصف من خلال الحفرة. وتكبير الشق إلى الصلبة و RPE.
ثم قم بإزالة الصلبة و RPE. بعد ذلك ، استخدم ملقط ذو أسنان دقيقة لإزالة العدسة برفق والجسم الزجاجي لعزل الشبكية العصبية. لجمع معلق الشبكية المتبرع ، احتضان الشبكية العصبية في محلول غراء عند 37 درجة مئوية لمدة 20 إلى 30 دقيقة حتى لا يتم اكتشاف كتل خلوية.
اجمع الخلايا المفردة باتباع تعليمات الشركة المصنعة لمجموعة Papain. لتحضير ورقة الشبكية ، ضع الشبكية المعزولة في طبق بتري مع برنامج تلفزيوني. ثم قطع الشبكية العصبية برفق إلى صفائح شبكية متعددة بمقص صغير.
تخدير الفئران المتلقية بحقن الكيتامين والزيلازين داخل الصفاق. تأكد من أن مستوى التخدير الذي تحقق هو المستوى الجراحي حيث يفقد وميض وردود فعل الألم ، ولكن التنفس والتنفس يبقى منتظما. قم بتقييم عمق التخدير عن طريق قرصة الذيل أو ردود فعل سحب الدواسة.
أعد فحص عمق التخدير أثناء إجراء العملية. احتفظ بالفئران على طاولة الجراحة التي تم تسخينها مسبقا لتجنب انخفاض حرارة الجسم. تمدد التلاميذ المتلقيين مع قطرات العين تروبيكاميد قبل خمس دقائق من الجراحة.
يمكن للتلميذ المتوسع جيدا تسهيل التصور عبر الحدقة تحت مجهر التشغيل. ضع قطرة من بروباراكايين هيدروكلوريد على عين الفئران للتسكين. تطهير عين الفأر العملية وأنسجة العين المحيطة باليود.
ثم تنظيف العين مع برنامج تلفزيوني معقمة. اختراق النفق المحيطي في الغرفة الداخلية لتقليل ضغط العين. بعد ذلك ، ضع قطرة من هيالورونات الصوديوم وغطاء زجاجي فوق القرنية.
التصور عبر الحدقة لقاع الفأر متاح الآن تحت النطاق الجراحي. كشف موضع الحقن عن طريق دفع جدار العين نحو مركز الرؤية عبر الحدقة باستخدام ملقط مسنن. ثم اخترق الصلبة جزئيا بإبرة حقن مجهرية ، تواجه 90 درجة إلى جدار العين.
يمكن أن تكون الأوعية الشبكية السطحية بمثابة مرجع تشريحي لتحديد موقع الإبرة داخل الفضاء تحت الشبكية. ثم حقن ترقيع الشبكية. يمكن أن تسهل الفقاعات الصغيرة المحملة مسبقا في المحقنة التحقق من صحة الموقع تحت الشبكية للخلايا المانحة.
إذا أصبحت القرنية غائمة ، احتفظ بالإبرة في الفضاء تحت الشبكية ، حتى تصبح القرنية شفافة لتطبيع ضغط العين. أمسك حافة فتحة الحقن واسحب الإبرة بسرعة. معيار التسليم الناجح لتعليق الخلية هو فقاعة ثابتة في الفضاء تحت الشبكية.
التسليم الناجح لورقة الشبكية ، مقتنع بورقة بيضاء مرئية. احتفظ بالفئران المزروعة في قفص تعافي نظيف تم تسخينه مسبقا ، وراقبها بعناية بحثا عن أي علامات استغاثة. في حالة حدوث ذلك ، ضع قطرة من هيدروكلوريد البروباراكايين الموضعي على العين الجراحية مرتين أو ثلاث مرات.
قم بإزالة الفئران مرة أخرى إلى قفص المنزل بعد أن تكون الفئران في حالة تأهب تام ومتحركة. ضع عددا صغيرا من كريات الطعام في كوب الهلام على أرضية القفص. إذا واجهت الفئران مشكلة في الوصول إلى قادوس الطعام.
بعد شهرين من الزرع ، تم إجراء تنظير العين بالليزر للمسح متعدد الوسائط للتحقق من حالات ترقيع الشبكية التي شوهدت في الجسم الحي. أظهر التصوير المقطعي للتماسك البصري للمجال الطيفي أن ترقيع الشبكية نجا في الفضاء تحت الشبكية ويعيد تشكيل الطبقة النووية الخارجية لجميع الفئران المتلقية. لم يكتشف التصوير بالأشعة تحت الحمراء أي إعتام عدسة العين واضح في جميع الفئران المزروعة.
تم اكتشاف مضاعفات جراحية أخرى ، بما في ذلك النزيف ، بشكل سيء في الفئران المزروعة عن طريق التصوير العاكس متعدد الألوان. أظهر التلوين النسيجي مستقبلات ضوئية مخروطية وفيرة تعبر عن OPN1LW: EGFP و S-opsin في صفائح الشبكية المزروعة. وبالمثل ، أظهرت معلقات خلايا الشبكية المزروعة نسبة كبيرة من المستقبلات الضوئية الإيجابية المستعادة في الجسم الحي ، بما في ذلك العديد من قضبان EGFP الإيجابية الناضجة.
أظهرت الفئران غير المزروعة انحطاطا شديدا للطبقة النووية الخارجية مع مستقبلات ضوئية مخروطية متفرقة تعبر عن الانتعاش. ومع ذلك ، لم يتم الكشف عن أي إشارة EGP في الفئران غير المزروعة. توفر هذه الدراسة منصة جراحية عبر الصلبة مع توجيه مباشر للرؤية عبر الحدقة لزراعة تحت الشبكية في متلقي الفئران.
تتيح هذه المنصة التسليم الدقيق للجرعات المعروفة من الخلايا. من السهل نسبيا تعلم وتسهيل الولادة تحت الشبكية بالإضافة إلى الحقن داخل الشبكية أو داخل الجسم الزجاجي لأنواع مختلفة من العوامل العلاجية ، بما في ذلك العلاج الجيني.
