Bu çalışmanın genel amacı, fare alıcılarında hücrelerin subretinal iletimini kolaylaştırmak için doğrudan transpupiller kılavuzlu bir trans-skleral transplantasyon platformu geliştirmektir. Tüm hayvan deneyleri Ulusal Sağlık Enstitüsü Rehberi'ne göre yapılmıştır. Johns Hopkins Üniversitesi Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanan ve hayvanların kullanımına ilişkin beyanımız.
Doğum sonrası 3-6. günde EGFP yaşını benimseyen fareler, retina hücresi süspansiyonlarının donörleri olarak kullanıldı. OPN1LW-EGFP/NRL fareleri, doğum sonrası 3. günde retina tabakası donörü olarak kabul edildi. İmmün yetmezliği olan yetişkin retina dejenerasyonu Rd1 / NS fareleri alıcı olarak kullanıldı.
Donör fareleri aşırı dozda karbondioksit ile ötenazi yapın. Farelerin gözbebeklerini izole etmek için, mikro bir makas kullanarak yavruların göz kapaklarını dikkatlice açın ve göz küresini ortaya çıkarın. Optik siniri sarın ve göz küresini düz forseps ile dışarı çekin.
Gözbebekleri izole edildikten sonra, 25 gauge iğne kullanarak korneanın ortasında bir delik açın. Korneayı delikten ikiye bölün. Ve kesiyi sklera ve RPE'ye genişletin.
Ardından sklera ve RPE'yi çıkarın. Ardından, nöral retinayı izole etmek için lensi ve vitreusu nazikçe çıkarmak için mikro dişli forseps kullanın. Donör retinal süspansiyonu toplamak için, nöral retinayı Papain solüsyonunda 37 santigrat derecede 20 ila 30 dakika boyunca hiçbir hücre kümesi tespit edilemene kadar inkübe edin.
Papain kitinin üreticisinin talimatlarını izleyerek tek hücreleri toplayın. Retina tabakası hazırlamak için, izole retinayı PBS'li bir Petri kabına koyun. Daha sonra nöral retinayı bir mikro makasla nazikçe birden fazla retina tabakasına kesin.
Alıcı fareleri intraperitoneal ketamin ve ksilazin enjeksiyonu ile uyuşturun. Anestezi düzleminin, hayvanın göz kırpma ve ağrı reflekslerini kaybettiği, ancak nefes alma ve solunumun düzenli kaldığı cerrahi düzlem olduğundan emin olun. Anestezi derinliğini kuyruk sıkışması veya pedal çekme refleksleri ile değerlendirin.
Ameliyat prosedürü sırasında anestezi derinliğini tekrar kontrol edin. Hipotermiyi önlemek için fareleri önceden ısıtılmış ameliyat masasında tutun. Ameliyattan beş dakika önce alıcı göz bebeklerini tropikamid göz damlası ile genişletin.
İyi genişlemiş bir göz bebeği, ameliyat mikroskobu altında transpupiller görselleştirmeyi kolaylaştırabilir. Analjezi için farelerin gözüne bir damla Proparakain hidroklorür koyun. Çalışan fare gözünü ve çevresindeki oküler dokuları iyot ile dezenfekte edin.
Ardından gözü steril PBS ile temizleyin. Göz içi basıncını azaltmak için periferik tüneli iç odaya girin. Daha sonra, korneanın üzerine bir damla sodyum hyaluronat ve bir cam lamel koyun.
Fare fundusunun transpupiller görselleştirmesi artık cerrahi kapsam altında mevcuttur. Dişli forseps ile göz duvarını transpupiller görüntünün merkezine doğru iterek enjeksiyon lokusunu ortaya çıkarın. Daha sonra skleraya bir mikroenjeksiyon iğnesi ile göz duvarına 90 derece bakacak şekilde kısmen nüfuz edin.
Yüzeysel retina damarları, iğneyi subretinal boşlukta bulmak için anatomik bir referans görevi görebilir. Ardından retina greftlerini enjekte edin. Şırıngadaki önceden yüklenmiş küçük kabarcıklar, donör hücrelerin subretinal konumunun doğrulanmasını kolaylaştırabilir.
Kornea bulanıklaşırsa, göz içi basıncını normalleştirmek için kornea saydam hale gelene kadar iğneyi subretinal boşlukta tutun. Enjeksiyon deliğinin kenarını kavrayın ve iğneyi hızla dışarı çekin. Hücre süspansiyonunun başarılı bir şekilde verilmesinin kriteri, subretinal boşlukta sabit bir kabarcıktır.
Retina tabakasının başarılı bir şekilde teslim edilmesi, görünür bir beyaz tabaka ile ikna edilir. Nakledilen fareleri önceden ısıtılmış temiz bir kurtarma kafesinde tutun ve herhangi bir tehlike belirtisi olup olmadığını dikkatlice izleyin. Bu meydana gelirse, cerrahi göze iki, üç kez bir damla topikal proparakain hidroklorür koyun.
Fareler tamamen uyanık ve hareketli hale geldikten sonra fareleri ev kafesine geri götürün. Kafesin zeminindeki jel kabına az sayıda yiyecek peleti yerleştirin. Fareler yiyecek haznesine ulaşmakta zorlanıyorsa.
Nakilden iki ay sonra, in vivo görülen retina greftlerinin durumlarını kontrol etmek için multimodal konfokal taramalı lazer oftalmoskopi yapıldı. Spektral alan optik koherens tomografi, retina greftlerinin subretinal boşlukta hayatta kaldığını ve tüm alıcı farelerin dış nükleer tabakasını yeniden oluşturduğunu gösterdi. Kızılötesi görüntüleme, nakledilen tüm farelerde belirgin bir katarakt tespit etmedi.
Kanama da dahil olmak üzere diğer cerrahi komplikasyonlar, nakledilen farelerde çok renkli yansıma görüntüleme ile kötü bir şekilde tespit edildi. Histolojik boyama, nakledilen retina tabakalarında OPN1LW:EGFP ve S-opsin eksprese eden bol miktarda koni fotoreseptörü gösterdi. Benzer şekilde, retina hücresi süspansiyonlarının nakli, çok sayıda olgun EGFP pozitif çubuk da dahil olmak üzere, in vivo olarak pozitif fotoreseptörlerin büyük bir kısmının geri kazanıldığını gösterdi.
Nakledilmeyen fareler, iyileşmeyi ifade eden seyrek kalıntı koni fotoreseptörleri ile dış nükleer tabakanın ciddi dejenerasyonunu gösterdi. Bununla birlikte, nakli yapılmayan farelerde EGP sinyali tespit edilmedi. Bu çalışma, fare alıcılarında subretinal transplantasyon için doğrudan transpupiller görme rehberliği ile trans-skleral cerrahi bir platform sağlar.
Bu platform, bilinen hücre dozlarının hassas bir şekilde verilmesini sağlar. Gen terapisi de dahil olmak üzere farklı terapötik ajan türleri için intra-retinal veya intravitreal enjeksiyonlara ek olarak subretinal doğumu öğrenmek ve kolaylaştırmak nispeten kolaydır.
