この研究の全体的な目標は、マウスレシピエントの網膜下送達を促進するための直接経瞳孔ガイダンスを備えた経強膜移植プラットフォームを開発することです。すべての動物実験は、国立衛生研究所の手引きに従って行われました。ジョンズ・ホプキンス大学動物管理委員会によって承認された動物の使用に関する声明。
出生後3〜6日目の年齢のEGFPマウスを採用し、網膜細胞懸濁液のドナーとして使用しました。OPN1LW-EGFP/NRLマウス、出生後3日目の年齢を網膜シートドナーとして採用した。免疫不全の成体網膜変性Rd1/NSマウスをレシピエントとして使用した。
ドナーマウスを二酸化炭素の過剰摂取で安楽死させる。マウスの眼球を分離するには、マイクロハサミを使用して子犬のまぶたを慎重に開き、眼球を露出させます。視神経を包み込み、滑らかな鉗子で眼球を引き出します。
眼球が分離されたら、25ゲージの針を使用して角膜の中央に穴を切開します。角膜を穴から半分に切ります。そして、強膜とRPEへの切開を拡大します。
次に、強膜とRPEを取り除きます。次に、微小歯鉗子を使用して水晶体を静かに取り外し、硝子体を使用して神経網膜を分離します。ドナー網膜懸濁液を採取するには、細胞凝集が検出されなくなるまで、37°Cのパパイン溶液中で神経網膜を20〜30分間インキュベートします。.
パパインキットの製造元の指示に従って単一細胞を回収します。網膜シートを調製するには、単離された網膜をPBSの入ったペトリ皿に入れます。次に、神経網膜をマイクロハサミで複数の網膜シートにそっと切ります。
レシピエントマウスにケタミンとキシラジンの腹腔内注射で麻酔をかけます。達成された麻酔面、つまり動物がまばたきと痛みの反射を失い、呼吸と呼吸が規則正しいままである手術面であることを確認してください。テールピンチまたはペダル離脱反射によって麻酔薬の深さを評価します。
手術中に麻酔薬の深さを再確認してください。低体温症を避けるために、マウスを事前に温めた手術台に置いてください。手術の5分前にトロピカミド点眼薬でレシピエントの瞳孔を拡張します。
瞳孔が十分に拡張すると、手術顕微鏡下での経瞳孔の可視化が容易になります。鎮痛のためのマウスの目にProparacaineの塩酸塩の落下を置きなさい。手術中のマウスの目と周囲の眼組織をヨウ素で消毒します。
次に、滅菌PBSで目をきれいにします。末梢トンネルを内部チャンバーに浸透させ、眼圧を下げます。次に、ヒアルロン酸ナトリウムを一滴垂らし、ガラスのカバーガラスを角膜の上に置きます。
マウス眼底の経瞳孔的可視化が手術スコープで利用できるようになりました。歯付き鉗子で眼壁を経瞳孔視の中心に向かって押して、注射座を露出させます。次に、眼壁に90度向いたマイクロ注射針で強膜を部分的に貫通します。
表在性網膜血管は、網膜下腔内で針の位置を特定するための解剖学的基準として役立つことができます。次に、網膜移植片を注入します。シリンジにプリロードされた小さな気泡は、ドナー細胞の網膜下位置の検証を容易にすることができます。
角膜が曇った場合は、角膜が透明になるまで針を網膜下腔に保持して眼圧を正常化します。注射穴の端をつかみ、針をすばやく引き抜きます。細胞懸濁液の送達を成功させるための基準は、網膜下腔の絶え間ないブレブです。
網膜シートの送達の成功は、目に見える白いシートによって確信されます。移植したマウスをあらかじめ温めた清潔な回復ケージに保管し、苦痛の兆候がないか注意深く監視します。これが発生した場合は、局所プロパラカイン塩酸塩を2、3回外科用眼に一滴垂らします。
マウスが完全に警戒して動き回った後、マウスをハウスケージに戻します。ケージの床にあるゲルカップに少量のフードペレットを置きます。マウスがフードホッパーに到達するのに問題がある場合。
移植後2ヶ月で、生体内で見られる網膜移植片の状態を確認するために、マルチモーダル共焦点走査型レーザー検眼鏡検査を実施しました。スペクトル領域光干渉断層撮影法は、網膜移植片が網膜下腔で生存し、すべてのレシピエントマウスの外側の核層を再構成することを示しました。赤外線画像では、移植されたすべてのマウスで明らかな白内障は検出されませんでした。
出血を含む他の外科的合併症は、移植されたマウスで多色反射画像法によってひどく検出されました。組織学的染色では、移植された網膜シートにOPN1LW:EGFPおよびS-オプシンを発現する錐体光受容体が豊富に見られました。同様に、網膜細胞懸濁液を移植すると、多数の成熟EGFP陽性桿体を含む、in vivoで陽性の光受容体を回復する大きな割合が示されました。
移植されていないマウスは、外核層の重度の変性を示し、回復を発現するまばらな残存錐体光受容体を示しました。しかし、移植されていないマウスではEGPシグナルは検出されませんでした。この研究は、マウスレシピエントの網膜下移植のための直接経瞳孔視力ガイダンスを備えた経強膜手術プラットフォームを提供します。
このプラットフォームにより、既知の用量の細胞を正確に送達できます。遺伝子治療を含むさまざまな種類の治療薬の網膜内または硝子体内注射に加えて、網膜下送達を学び、促進することは比較的簡単です。
