O objetivo geral deste estudo é desenvolver uma plataforma de transplante transescleral com orientação transpupilar direta para facilitar a entrega sub-retiniana de células em receptores de camundongos. Todos os experimentos com animais foram realizados de acordo com o National Institute of Health Guide. Nossa declaração do uso de animais e aprovada pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais da Universidade Johns Hopkins.
Adotando a idade de camundongos EGFP no dia pós-natal 3-6 foram usados como doadores de suspensões de células da retina. Camundongos OPN1LW-EGFP/NRL, com idade no 3º dia pós-natal, foram adotados como doadores de lençol de retina. Camundongos adultos com degeneração retiniana Rd1/NS com imunodeficiência foram usados como receptores.
Eutanásia de camundongos doadores com overdose de dióxido de carbono. Para isolar os globos oculares dos camundongos, abra cuidadosamente as pálpebras dos filhotes usando uma microtesoura e exponha o globo ocular. Envolva o nervo óptico e puxe o globo ocular com pinça lisa.
Uma vez que os globos oculares são isolados, incise um orifício no centro da córnea usando uma agulha de calibre 25. Corte a córnea ao meio através do buraco. E ampliar a incisão para a esclera e PSE.
Em seguida, remova a esclera e a PSE. Em seguida, use pinças microdentadas para remover suavemente o cristalino e o vítreo para isolar a retina neural. Para coletar a suspensão da retina do doador, incubar a retina neural em solução de papaína a 37 centígrados por 20 a 30 minutos até que nenhum aglomerado celular seja detectável.
Coletar as células individuais seguindo as instruções do fabricante do kit de papaína. Para preparar a folha de retina, coloque a retina isolada em uma placa de Petri com PBS. Em seguida, corte suavemente a retina neural em várias folhas de retina com uma micro tesoura.
Anestesiar camundongos receptores com uma injeção intraperitoneal de quetamina e xilazina. Certifique-se de que o plano de anestesia alcançado seja o plano cirúrgico onde o animal perde reflexos de piscar e dor, mas a respiração e a respiração permanecem regulares. Avaliar a profundidade anestésica por meio da pinça da cauda ou dos reflexos de retirada do pedal.
Verificar novamente a profundidade anestésica durante o procedimento operatório. Mantenha os ratos na mesa de cirurgia pré-aquecida para evitar hipotermia. Dilatar as pupilas receptoras com colírio de tropicamida cinco minutos antes da cirurgia.
Uma pupila bem dilatada pode facilitar a visualização transpupilar ao microscópio cirúrgico. Coloque uma gota de cloridrato de proparacaína no olho de ratos para analgesia. Desinfetar o olho do rato em operação e os tecidos oculares circundantes com iodo.
Em seguida, limpe o olho com PBS estéril. Penetrar o túnel periférico na câmara interna para reduzir a pressão intraocular. Em seguida, coloque uma gota de hialuronato de sódio e uma tampa de vidro em cima da córnea.
A visualização transpupilar do fundo de olho de camundongo está agora disponível sob o escopo cirúrgico. Expor o locus de injeção empurrando a parede do olho em direção ao centro do visual transpupilar com pinça dentada. Em seguida, penetre parcialmente na esclera com uma agulha de microinjeção, voltada 90 graus para a parede do olho.
Os vasos superficiais da retina podem servir como referência anatômica para localizar a agulha dentro do espaço sub-retiniano. Em seguida, injete os enxertos de retina. As pequenas bolhas pré-carregadas na seringa podem facilitar a validação da localização sub-retiniana das células doadoras.
Se a córnea ficar turva, mantenha a agulha no espaço sub-retiniano, até que a córnea se torne transparente para normalizar a pressão intraocular. Segure a borda do orifício de injeção e puxe rapidamente a agulha. O critério para o sucesso da liberação da suspensão celular é uma constante bleb no espaço sub-retiniano.
Uma entrega bem-sucedida de lençol de retina, é convencida por uma folha branca visível. Mantenha os ratos transplantados em uma gaiola de recuperação limpa pré-aquecida e monitore-os cuidadosamente em busca de quaisquer sinais de angústia. Se isso ocorrer, coloque uma gota de cloridrato de proparacaína tópica no olho cirúrgico por duas, três vezes.
Remova os ratos de volta para a gaiola de casa depois que os ratos estiverem completamente alertas e móveis. Coloque um pequeno número de pellets de comida no copo de gel no chão da gaiola. Se os ratos tiverem problemas para alcançar o funil de comida.
Dois meses após o transplante, foi realizada oftalmoscopia a laser de varredura confocal multimodal para verificar o estado dos enxertos de retina vistos vivo. A tomografia de coerência óptica de domínio espectral mostrou que os enxertos de retina sobreviveram no espaço sub-retiniano e reconstituem a camada nuclear externa de todos os camundongos receptores. A imagem infravermelha não detectou catarata óbvia em todos os camundongos transplantados.
Outras complicações cirúrgicas, incluindo hemorragia, foram gravemente detectadas em camundongos transplantados por imagem de reflectância multicolorida. A coloração histológica mostrou fotorreceptores cônicos abundantes expressando OPN1LW:EGFP e S-opsin em lâminas de retina transplantadas. Da mesma forma, as suspensões de células retinianas transplantadas mostraram uma grande proporção de fotorreceptores positivos em recuperação in vivo, incluindo numerosos bastonetes maduros positivos para EGFP.
Os camundongos não transplantados apresentaram degeneração severa da camada nuclear externa com fotorreceptores residuais esparsos expressando recuperação. No entanto, nenhum sinal de EGP foi detectado em camundongos não transplantados. Este estudo fornece uma plataforma cirúrgica transescleral com orientação direta da visão transpupilar para transplante sub-retiniano em receptores de camundongos.
Esta plataforma permite a entrega precisa de doses conhecidas de células. É relativamente fácil aprender e facilitar a entrega sub-retiniana, além de injeções intra-retinianas ou intravítreas para diferentes tipos de agentes terapêuticos, incluindo terapia gênica.
