המטרה הכוללת של מחקר זה היא לפתח פלטפורמת השתלה טרנס-סקלרלית עם הנחיה טרנס-אישונים ישירה כדי להקל על העברת תאים תת-רשתית אצל מושתלי עכבר. כל הניסויים בבעלי חיים בוצעו על פי מדריך המכון הלאומי לבריאות. ההצהרה שלנו על השימוש בבעלי חיים ואושרה על ידי הוועדה לטיפול ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטת ג'ונס הופקינס.
אימוץ עכברי EGFP בגיל ביום 3-6 לאחר הלידה שימשו כתורמים של תרחיפים של תאי רשתית. עכברי OPN1LW-EGFP/NRL, שגילם ביום 3 לאחר הלידה אומצו כתורמי יריעות רשתית. עכברים בוגרים עם ניוון רשתית Rd1/NS עם חסר חיסוני שימשו כמושתלים.
הרדימו עכברים תורמים עם מנת יתר של פחמן דו חמצני. כדי לבודד את גלגלי העיניים של עכברים, פתחו בזהירות את העפעפיים של הגורים באמצעות מספריים מיקרו וחשפו את גלגל העין. לעטוף את עצב הראייה, ולשלוף את גלגל העין עם מלקחיים חלקים.
לאחר בידוד גלגלי העיניים, חותכים חור במרכז הקרנית באמצעות מחט של 25 מד. חותכים את הקרנית לשניים דרך החור. ולהגדיל את החתך לסקלרה ול-RPE.
לאחר מכן הסר את לובן העין ואת RPE. לאחר מכן, השתמש במלקחיים מיקרו-שיניים כדי להסיר בעדינות את העדשה ואת הזגוגית כדי לבודד את הרשתית העצבית. כדי לאסוף את תרחיף הרשתית של התורם, דגרו על הרשתית העצבית בתמיסת פפאין ב 37 מעלות צלזיוס למשך 20 עד 30 דקות עד שלא ניתן לזהות גושי תאים.
אסוף את התאים הבודדים בהתאם להוראות היצרן של ערכת הפפאין. כדי להכין יריעת רשתית, הכניסו את הרשתית המבודדת לצלחת פטרי עם PBS. לאחר מכן חתכו בעדינות את הרשתית העצבית ליריעות רשתית מרובות בעזרת מספריים מיקרו.
מרדימים עכברים מושתלים עם הזרקה intraperitoneal של קטמין ו xylazine. ודא כי מישור ההרדמה השיג כי הוא המטוס הכירורגי שבו החיה מאבדת מצמוץ ורפלקסים כאב, אבל נשימה ונשימה נשאר סדיר. הערך את עומק ההרדמה על ידי צביטת זנב או רפלקסי נסיגה מהדוושה.
בדוק שוב את עומק ההרדמה במהלך הניתוח. שמור את העכברים על שולחן הניתוח שחומם מראש כדי למנוע היפותרמיה. הרחבת אישונים מושתלים עם טיפות עיניים טרופיקמיד חמש דקות לפני הניתוח.
אישון מורחב היטב יכול להקל על הדמיה transpupillary תחת מיקרוסקופ ההפעלה. שים טיפה של Proparacaine hydrochloride על עין עכברים עבור שיכוך כאבים. יש לחטא את עין העכבר המנתחת ואת רקמות העין הסובבות אותה ביוד.
ואז לנקות את העין עם PBS סטרילי. לחדור את התעלה ההיקפית לתוך החדר הפנימי כדי להפחית את הלחץ תוך עיני. לאחר מכן, לשים טיפה של hyaluronate נתרן וכיסוי זכוכית על גבי הקרנית.
הדמיה טרנס-אישונים של פונדוס העכבר זמינה כעת תחת היקף הניתוח. חשוף את מוקד ההזרקה על ידי דחיפת דופן העין לכיוון מרכז הראייה transpupillary עם מלקחיים שיניים. ואז לחדור חלקית את לובן העין עם מחט microinjection, מול 90 מעלות אל דופן העין.
כלי הרשתית השטחיים יכולים לשמש כהפניה אנטומית למיקום המחט בתוך החלל התת רשתית. לאחר מכן להזריק את השתלים ברשתית. הבועות הקטנות הטעונות מראש במזרק יכולות להקל על אימות המיקום התת-רשתית של תאי התורם.
אם הקרנית הופכת לעכורה, שמור את המחט בחלל התת-רשתית, עד שהקרנית הופכת שקופה כדי לנרמל את הלחץ התוך עיני. אחזו בקצה חור ההזרקה ושלפו במהירות את המחט. הקריטריון למסירה מוצלחת של השעיית תאים הוא כתם קבוע בחלל התת רשתית.
מסירה מוצלחת של גיליון רשתית, משוכנעת על ידי סדין לבן גלוי. החזיקו עכברים מושתלים בכלוב התאוששות נקי שחומם מראש, והשגיחו עליהם בקפידה לאיתור סימני מצוקה. אם זה קורה, לשים טיפה של proparacaine hydrochloride מקומי על העין כירורגית במשך פעמיים, שלוש.
הוציאו את העכברים חזרה לכלוב הבית לאחר שהעכברים יהיו ערניים וניידים לחלוטין. מניחים מספר קטן של כדורי מזון בכוס הג'ל על רצפת הכלוב. אם העכברים מתקשים להגיע להופר המזון.
חודשיים לאחר ההשתלה בוצעה אופתלמוסקופיה לייזר מולטימודאלית לסריקה קונפוקלית כדי לבדוק את מצבם של שתלי רשתית שנראים חיים. טומוגרפיית קוהרנטיות אופטית בתחום הספקטרלי הראתה כי שתלי רשתית שרדו בחלל התת-רשתית ומהווים מחדש את השכבה הגרעינית החיצונית של כל העכברים המושתלים. הדמיית אינפרא אדום לא זיהתה קטרקט ברור בכל העכברים המושתלים.
סיבוכים כירורגיים אחרים, כולל דימום, התגלו קשות בעכברים מושתלים על ידי הדמיית השתקפות צבעונית. צביעה היסטולוגית הראתה שפע של פוטורצפטורים חרוטים המבטאים OPN1LW:EGFP ו-S-opsin ביריעות רשתית מושתלות. כמו כן, השתלת תרחיפים של תאי רשתית הראתה שיעור גדול של פוטורצפטורים חיוביים ב- vivo, כולל מוטות חיוביים בוגרים רבים של EGFP.
העכברים שלא הושתלו הראו ניוון חמור של שכבת הגרעין החיצונית עם פוטורצפטורים שיוריים דלילים של חרוט המבטאים התאוששות. עם זאת, לא זוהה אות EGP בעכברים שאינם מושתלים. מחקר זה מספק פלטפורמה כירורגית טרנס-סקלרלית עם הנחיית ראייה טרנס-אישונים ישירה להשתלה תת-רשתית במושתלי עכבר.
פלטפורמה זו מאפשרת העברה מדויקת של מינונים ידועים של תאים. קל יחסית ללמוד ולהקל על מתן תת רשתית בנוסף לזריקות תוך רשתית או תוך ויטריאלית לסוגים שונים של חומרים טיפוליים, כולל ריפוי גנטי.
