El objetivo general de este estudio es desarrollar una plataforma de trasplante transescleral con guía transpupilar directa para facilitar la administración subretiniana de células en receptores de ratón. Todos los experimentos con animales se llevaron a cabo de acuerdo con la Guía del Instituto Nacional de Salud. Nuestra declaración sobre el uso de animales y aprobada por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Johns Hopkins.
Se utilizaron ratones adoptivos de EGFP de edad en el día postnatal 3-6 como donantes de suspensiones de células de la retina. Los ratones OPN1LW-EGFP/NRL, con edad al día 3 postnatal, fueron adoptados como donantes de láminas de retina. Se utilizaron como receptores ratones adultos Rd1/NS con degeneración retiniana e inmunodeficiencia.
Sacrificar ratones donantes con dióxido de carbono por sobredosis. Para aislar los globos oculares de los ratones, abra con cuidado los párpados de los cachorros con una microtijera y exponga el globo ocular. Envuelva el nervio óptico y saque el globo ocular con unas pinzas suaves.
Una vez que los globos oculares estén aislados, haga una incisión en un orificio en el centro de la córnea con una aguja de calibre 25. Corta la córnea por la mitad a través del agujero. Y agrandar la incisión hasta la esclerótica y el EPR.
A continuación, retire la esclerótica y el EPR. A continuación, utilice unas pinzas microdentadas para retirar suavemente el cristalino y el vítreo para aislar la retina neural. Para recolectar la suspensión de retina del donante, incube la retina neural en una solución de papaína a 37 grados centígrados durante 20 a 30 minutos hasta que no se detecten grupos celulares.
Recoja las células individuales siguiendo las instrucciones del fabricante del kit Papain. Para preparar la lámina de retina, coloque la retina aislada en una placa de Petri con PBS. A continuación, corte suavemente la retina neural en varias láminas de retina con una microtijera.
Anestesiar ratones receptores con una inyección intraperitoneal de ketamina y xilacina. Procurar que el plano de anestesia logrado es el plano quirúrgico donde el animal pierde el parpadeo y los reflejos de dolor, pero la respiración y la respiración se mantienen regulares. Evalúe la profundidad anestésica mediante el pellizco de la cola o los reflejos de retirada del pedal.
Vuelva a verificar la profundidad anestésica durante el procedimiento quirúrgico. Mantenga a los ratones en la mesa de cirugía precalentada para evitar la hipotermia. Dilatar las pupilas receptoras con gotas oftálmicas de tropicamida cinco minutos antes de la cirugía.
Una pupila bien dilatada puede facilitar la visualización transpupilar bajo el microscopio quirúrgico. Coloque una gota de clorhidrato de proparacaína en el ojo del ratón para la analgesia. Desinfecte el ojo del ratón en operación y los tejidos oculares circundantes con yodo.
A continuación, limpie el ojo con PBS estéril. Penetrar el túnel periférico en la cámara interna para reducir la presión intraocular. A continuación, coloque una gota de hialuronato de sodio y un cubreobjetos de vidrio sobre la córnea.
La visualización transpupilar del fondo de ojo del ratón ya está disponible en el ámbito quirúrgico. Exponga el lugar de la inyección empujando la pared del ojo hacia el centro de la visual transpupilar con pinzas dentadas. A continuación, penetre parcialmente en la esclerótica con una aguja de microinyección, mirando 90 grados hacia la pared del ojo.
Los vasos retinianos superficiales pueden servir como referencia anatómica para ubicar la aguja dentro del espacio subretiniano. A continuación, inyecte los injertos de retina. Las pequeñas burbujas precargadas en la jeringa pueden facilitar la validación de la ubicación subretiniana de las células del donante.
Si la córnea se vuelve opaca, mantenga la aguja en el espacio subretiniano, hasta que la córnea se vuelva transparente para normalizar la presión intraocular. Sujete el borde del orificio de inyección y saque rápidamente la aguja. El criterio para el éxito de la suspensión celular es una ampolla constante en el espacio subretiniano.
Una entrega exitosa de la lámina de retina, está convencida por una lámina blanca visible. Mantenga a los ratones trasplantados en una jaula de recuperación limpia y precalentada y vigílelos cuidadosamente para detectar cualquier signo de angustia. Si esto ocurre, coloque una gota de clorhidrato de proparacaína tópica en el ojo quirúrgico dos o tres veces.
Retira a los ratones de vuelta a la jaula de la casa después de que estén completamente alerta y móviles. Coloque una pequeña cantidad de gránulos de comida en el vaso de gel en el piso de la jaula. Si los ratones tienen problemas para alcanzar la tolva de comida.
Dos meses después del trasplante, se realizó oftalmoscopia láser de barrido confocal multimodal para comprobar el estado de los injertos de retina observados vivo. La tomografía de coherencia óptica de dominio espectral mostró que los injertos de retina sobrevivieron en el espacio subretiniano y reconstituyen la capa nuclear externa de todos los ratones receptores. Las imágenes infrarrojas no detectaron cataratas obvias en todos los ratones trasplantados.
Otras complicaciones quirúrgicas, incluida la hemorragia, se detectaron mal en ratones trasplantados mediante imágenes de reflectancia multicolor. La tinción histológica mostró abundantes fotorreceptores de cono que expresan OPN1LW:EGFP y S-opsina en láminas retinianas trasplantadas. Del mismo modo, el trasplante de suspensiones celulares de la retina mostró una gran proporción de recuperación de fotorreceptores positivos in vivo, incluidos numerosos bastones positivos de EGFP maduros.
Los ratones no trasplantados mostraron una degeneración severa de la capa nuclear externa con escasos fotorreceptores de cono residuales que expresan recuperación. Sin embargo, no se detectó ninguna señal de EGP en ratones no trasplantados. Este estudio proporciona una plataforma quirúrgica transescleral con orientación visual transpupilar directa para el trasplante subretiniano en receptores de ratón.
Esta plataforma permite la administración precisa de dosis conocidas de células. Es relativamente fácil aprender y facilitar la administración subretiniana, además de las inyecciones intrarretinianas o intravítreas para diferentes tipos de agentes terapéuticos, incluida la terapia génica.
