이 연구의 전반적인 목표는 마우스 수용자에서 세포의 망막하 전달을 촉진하기 위해 직접적인 동공 유도가 있는 경공막 이식 플랫폼을 개발하는 것입니다. 모든 동물 실험은 미국 국립보건원(National Institute of Health Guide)에 따라 수행되었습니다. 존스 홉킨스 대학 동물 관리 및 사용 위원회(Johns Hopkins University Animal Care and Use Committee)의 승인을 받은 동물 사용에 대한 당사의 성명서.
출생 후 3-6일째에 EGFP 마우스를 채택하여 망막 세포 현탁액의 기증자로 사용하였다. 출생 후 3일째의 연령인 OPN1LW-EGFP/NRL 마우스를 망막 시트 기증자로 채택했습니다. 면역 결핍이 있는 성인 망막 변성 Rd1/NS 마우스를 수혜자로 사용하였다.
이산화탄소를 과다 투여한 기증자 쥐를 안락사시킨다. 쥐의 안구를 분리하려면 마이크로 가위를 사용하여 새끼의 눈꺼풀을 조심스럽게 열고 안구를 노출시킵니다. 시신경을 감싸고 부드러운 집게로 안구를 빼냅니다.
안구가 분리되면 25게이지 바늘을 사용하여 각막 중앙에 구멍을 뚫습니다. 구멍을 통해 각막을 반으로 자릅니다. 그리고 절개 부위를 공막과 RPE로 확대합니다.
그런 다음 공막과 RPE를 제거합니다. 그런 다음 마이크로 톱니 겸자를 사용하여 수정체를 부드럽게 제거하고 유리체를 제거하여 신경 망막을 분리합니다. 기증자 망막 현탁액을 채취하려면 세포 덩어리가 검출되지 않을 때까지 섭씨 37도의 파파인 용액에서 20-30분 동안 신경 망막을 배양합니다.
Papain 키트에 대한 제조업체의 지침에 따라 단일 세포를 수집합니다. 망막 시트를 준비하려면 분리된 망막을 PBS가 있는 페트리 접시에 넣습니다. 그런 다음 마이크로 가위로 신경 망막을 여러 개의 망막 시트로 부드럽게 자릅니다.
케타민과 자일라진의 복강 내 주사로 수용 마우스를 마취합니다. 동물이 눈 깜빡임과 통증 반사를 잃지만 호흡과 호흡이 규칙적으로 유지되는 수술 평면인 마취 평면이 달성되었는지 확인하십시오. 꼬리 꼬집기 또는 페달 철수 반사로 마취 깊이를 평가합니다.
수술 중 마취 깊이를 다시 확인하십시오. 저체온증을 피하기 위해 미리 예열된 수술 테이블 위에 마우스를 두십시오. 수술 5분 전에 트로피카미드 점안액으로 수혜자의 동공을 확장시킵니다.
동공이 잘 확장되면 작동 현미경에서 동공 경관의 시각화를 용이하게 할 수 있습니다. 진통을 위해 생쥐 눈에 Proparacaine hydrochloride 한 방울을 떨어뜨립니다. 수술하는 쥐의 눈과 주변 안구 조직을 요오드로 소독합니다.
그런 다음 멸균 PBS로 눈을 씻으십시오. 주변 터널을 내부 챔버로 침투시켜 안압을 낮춥니다. 다음으로 히알루론산나트륨 한 방울과 유리 커버슬립을 각막 위에 올린다.
이제 쥐 안저의 동공 경공 시각화를 수술 범위에서 사용할 수 있습니다. 이빨이 있는 집게로 안벽을 동공 경안의 중앙으로 밀어 주사 위치를 노출시킵니다. 그런 다음 미세 주사 바늘로 공막을 부분적으로 관통하여 안벽과 90도를 향하게 합니다.
표재성 망막 혈관은 망막하 공간 내에서 바늘을 찾기 위한 해부학적 참조 역할을 할 수 있습니다. 그런 다음 망막 이식편을 주입합니다. 주사기에 미리 로드된 작은 기포는 기증자 세포의 망막하 위치를 쉽게 확인할 수 있습니다.
각막이 뿌옇게 되면 각막이 투명해질 때까지 바늘을 망막하 공간에 두어 안압을 정상화합니다. 주입 구멍의 가장자리를 잡고 바늘을 빠르게 빼냅니다. 세포 현탁액의 성공적인 전달을 위한 기준은 망막하 공간의 일정한 블레브입니다.
망막 시트의 성공적인 전달은 눈에 보이는 흰색 시트에 의해 확신됩니다. 이식된 쥐를 미리 따뜻해진 깨끗한 회복 케이지에 보관하고 조난 징후가 있는지 주의 깊게 모니터링하십시오. 이 경우 국소 프로파라카인 염산염을 수술 눈에 2, 3회 한 방울 떨어뜨립니다.
생쥐가 완전히 경계하고 움직일 수 있게 된 후 생쥐를 집 케이지로 다시 옮깁니다. 케이지 바닥의 젤 컵에 소량의 음식 알갱이를 놓습니다. 쥐가 음식 호퍼에 도달하는 데 문제가 있는 경우.
이식 2개월 후, 생체 내에서 관찰된 망막 이식편의 상태를 확인하기 위해 다중 모드 컨포칼 스캐닝 레이저 검안경을 수행했습니다. 스펙트럼 영역 광간섭 단층촬영은 망막 이식편이 망막하 공간에서 생존하고 모든 수용 마우스의 외부 핵층을 재구성한다는 것을 보여주었습니다. 적외선 영상은 이식된 모든 쥐에서 명백한 백내장을 발견하지 못했습니다.
출혈을 포함한 다른 수술 합병증은 이식된 마우스에서 다색 반사 영상에 의해 심하게 감지되었습니다. 조직학적 염색은 이식된 망막 시트에서 OPN1LW:EGFP 및 S-opsin을 발현하는 풍부한 원뿔 광수용체를 보여주었습니다. 마찬가지로, 망막 세포 현탁액을 이식한 결과, 생체 내에서 회복되는 양성 광수용체의 비율이 높았으며, 여기에는 수많은 성숙한 EGFP 양성 간상체가 포함되었습니다.
이식되지 않은 마우스는 회복을 표현하는 희박한 잔류 원뿔 광수용체와 함께 외부 핵층의 심각한 퇴화를 보여주었습니다. 그러나, 이식되지 않은 마우스에서는 EGP 신호가 검출되지 않았다. 이 연구는 마우스 수혜자의 망막하 이식을 위한 직접적인 동공경 시력 안내가 있는 경공막 수술 플랫폼을 제공합니다.
이 플랫폼을 사용하면 알려진 용량의 세포를 정확하게 전달할 수 있습니다. 유전자 치료를 포함한 다양한 유형의 치료제에 대한 망막내 또는 유리체내 주사 외에도 망막하 전달을 배우고 촉진하는 것은 비교적 쉽습니다.
