Общей целью этого исследования является разработка платформы транссклеральной трансплантации с прямым транспуплярным контролем для облегчения субретинальной доставки клеток у мышей-реципиентов. Все эксперименты на животных проводились в соответствии с Национальным институтом здравоохранения. Наше заявление об использовании животных одобрено Комитетом по уходу за животными и использованию животных Университета Джонса Хопкинса.
В качестве доноров суспензий клеток сетчатки использовали мышей, принявших EGFP на 3-6 сутки после рождения. Мыши OPN1LW-EGFP/NRL, возраст которых на 3-е сутки после рождения, были приняты в качестве доноров пластинчатки сетчатки. В качестве реципиентов использовали взрослых мышей с дегенерацией сетчатки Rd1/NS с иммунодефицитом.
Усыпляйте мышей-доноров при передозировке углекислого газа. Чтобы изолировать глазные яблоки мышей, осторожно откройте веки щенков с помощью микроножниц и обнажите глазное яблоко. Оберните зрительный нерв и вытащите глазное яблоко гладкими щипцами.
После того, как глазные яблоки будут изолированы, сделайте надрез отверстия в центре роговицы с помощью иглы 25-го калибра. Разрежьте роговицу пополам через отверстие. И увеличить разрез до склеры и РПЭ.
Затем удалите склеру и РПЭ. Затем с помощью микрозубчатых щипцов аккуратно удалите хрусталик и стекловидное тело, чтобы изолировать нервную сетчатку. Чтобы собрать донорскую суспензию сетчатки, инкубируйте нервную сетчатку в растворе папаина при температуре 37 градусов Цельсия в течение 20-30 минут до тех пор, пока не будут обнаружены скопления клеток.
Соберите одиночные клетки, следуя инструкциям производителя набора Папаин. Чтобы подготовить лист сетчатки, поместите изолированную сетчатку в чашку Петри с PBS. Затем аккуратно разрежьте нервную сетчатку на несколько листов сетчатки с помощью микроножниц.
Обезболивайте мышей-реципиентов внутрибрюшинной инъекцией кетамина и ксилазина. Убедитесь, что плоскость анестезии достигнута, то есть является хирургической плоскостью, в которой животное теряет моргание и болевые рефлексы, но дыхание и дыхание остаются нормальными. Оцените глубину анестезии по защемлению хвоста или рефлексам отведения педали.
Повторно проверьте глубину анестезии во время операции. Держите мышей на предварительно разогретом операционном столе, чтобы избежать переохлаждения. Расширьте зрачки реципиента с помощью глазных капель с тропикамидом за пять минут до операции.
Хорошо расширенный зрачок может облегчить трансзрачковую визуализацию под операционным микроскопом. Капните каплю пропаракаина гидрохлорида на глаз мыши для обезболивания. Продезинфицируйте оперирующий глаз мыши и окружающие глазные ткани йодом.
Затем промойте глаз стерильным ПБС. Проникают через периферический туннель во внутреннюю камеру для снижения внутриглазного давления. Затем нанесите каплю гиалуроната натрия и стеклянный покровный листок поверх роговицы.
Транспупиллярная визуализация глазного дна мыши теперь доступна под хирургическим эндоскопом. Обнажайте место инъекции, прижимая стенку глаза к центру транспупиллярного зрения зубчатыми щипцами. Затем частично проникают в склеру иглой для микроинъекций, повернув на 90 градусов к глазной стенке.
Поверхностные сосуды сетчатки могут служить анатомическим ориентиром для определения местоположения иглы в субретинальном пространстве. Затем вводят трансплантаты сетчатки. Предварительно загруженные мелкие пузырьки в шприце могут облегчить валидацию субретинального расположения донорских клеток.
Если роговица помутнела, держите иглу в субретинальном пространстве, пока роговица не станет прозрачной, чтобы нормализовать внутриглазное давление. Возьмитесь за край отверстия для инъекций и быстро вытащите иглу. Критерием успешной доставки клеточной суспензии является постоянный пузырь в субретинальном пространстве.
В успешной сдаче сетчатого листа убеждает видимый белый лист. Держите пересаженных мышей в предварительно разогретой чистой клетке для восстановления и внимательно следите за ними на предмет любых признаков бедствия. В этом случае капните каплю местного пропаракаина гидрохлорида на хирургический глаз два-три раза.
Уберите мышей обратно в клетку после того, как они полностью насторожятся и станут подвижными. Поместите небольшое количество гранул корма в гелевый стаканчик на пол клетки. Если мышам трудно добраться до бункера для еды.
Через два месяца после трансплантации была проведена мультимодальная конфокальная сканирующая лазерная офтальмоскопия для проверки состояния трансплантатов сетчатки, наблюдаемых естественными условиями. Спектральная оптическая когерентная томография показала, что трансплантаты сетчатки выживают в субретинальном пространстве и восстанавливают внешний ядерный слой всех мышей-реципиентов. Инфракрасная визуализация не обнаружила явной катаракты у всех пересаженных мышей.
Другие хирургические осложнения, включая кровоизлияние, были плохо выявлены у трансплантированных мышей с помощью многоцветной отражательной визуализации. Гистологическое окрашивание показало обильное количество фоторецепторов колбочек, экспрессирующих OPN1LW:EGFP и S-opsin в трансплантированных листах сетчатки. Аналогичным образом, трансплантация клеточных суспензий сетчатки показала большую долю восстанавливающихся положительных фоторецепторов in vivo, включая многочисленные зрелые EGFP-положительные палочки.
У нетрансплантированных мышей наблюдалась тяжелая дегенерация наружного ядерного слоя с редкими остаточными фоторецепторами колбочек, экспрессирующими восстановление. Тем не менее, сигнал EGP не был обнаружен у нетрансплантированных мышей. Это исследование предоставляет транссклеральную хирургическую платформу с прямым транспупиллярным зрением для субретинальной трансплантации у мышей-реципиентов.
Эта платформа обеспечивает точную доставку известных доз клеток. Относительно легко освоить и облегчить субретинальную доставку в дополнение к интраретинальным или интравитреальным инъекциям для различных типов терапевтических агентов, включая генную терапию.
