Das übergeordnete Ziel dieser Studie ist es, eine transsklerale Transplantationsplattform mit direkter transpupillärer Führung zu entwickeln, um die subretinale Verabreichung von Zellen bei Mausempfängern zu erleichtern. Alle Tierversuche wurden gemäß dem Leitfaden des National Institute of Health durchgeführt. Unsere Erklärung zur Verwendung von Tieren, die vom Animal Care and Use Committee der Johns Hopkins University genehmigt wurde.
Die Annahme des EGFP-Alters von Mäusen am postnatalen Tag 3-6 wurde als Spender von Netzhautzellsuspensionen verwendet. OPN1LW-EGFP/NRL-Mäuse im Alter von postnatalem Tag 3 wurden als Netzhautblattspender adoptiert. Als Empfänger wurden adulte Rd1/NS-Mäuse mit Netzhautdegeneration und Immunschwäche verwendet.
Euthanasie von Spendermäusen mit einer Überdosis Kohlendioxid. Um die Augäpfel von Mäusen zu isolieren, öffnen Sie vorsichtig die Augenlider der Jungtiere mit einer Mikroschere und legen Sie den Augapfel frei. Wickeln Sie den Sehnerv ein und ziehen Sie den Augapfel mit einer glatten Pinzette heraus.
Sobald die Augäpfel isoliert sind, schneiden Sie mit einer 25-Gauge-Nadel ein Loch in die Mitte der Hornhaut. Schneiden Sie die Hornhaut durch das Loch in zwei Hälften. Und vergrößern Sie den Schnitt bis zur Sklera und RPE.
Entfernen Sie dann die Sklera und RPE. Verwenden Sie als Nächstes eine mikroverzahnte Pinzette, um die Linse vorsichtig zu entfernen, und Glaskörper, um die neurale Netzhaut zu isolieren. Um die Spender-Netzhautsuspension zu gewinnen, inkubieren Sie die neurale Netzhaut in Papain-Lösung bei 37 Grad Celsius für 20 bis 30 Minuten, bis keine Zellklumpen mehr nachweisbar sind.
Entnehmen Sie die einzelnen Zellen gemäß den Anweisungen des Herstellers des Papain-Kits. Um ein Netzhautblatt vorzubereiten, legen Sie die isolierte Netzhaut in eine Petrischale mit PBS. Schneiden Sie dann die neurale Netzhaut vorsichtig mit einer Mikroschere in mehrere Netzhautschichten.
Anästhesieren Sie Empfängermäuse mit einer intraperitonealen Injektion von Ketamin und Xylazin. Stellen Sie sicher, dass die erreichte Anästhesieebene die chirurgische Ebene ist, bei der das Tier Blinzeln und Schmerzreflexe verliert, aber Atmung und Atmung regelmäßig bleiben. Beurteilen Sie die Narkosetiefe durch das Einklemmen des Schwanzes oder die Pedalrückzugsreflexe.
Überprüfen Sie die Narkosetiefe während des operativen Eingriffs erneut. Bewahren Sie die Mäuse auf dem vorgewärmten Operationstisch auf, um eine Unterkühlung zu vermeiden. Erweitern Sie die Pupillen des Empfängers fünf Minuten vor der Operation mit Tropicamid Augentropfen.
Eine gut erweiterte Pupille kann die transpupilläre Darstellung unter dem Operationsmikroskop erleichtern. Geben Sie einen Tropfen Proparacainhydrochlorid zur Analgesie auf das Auge der Maus. Desinfizieren Sie das operierende Mausauge und das umgebende Augengewebe mit Jod.
Reinigen Sie anschließend das Auge mit sterilem PBS. Eindringen in den peripheren Tunnel in die innere Kammer, um den Augeninnendruck zu senken. Geben Sie als Nächstes einen Tropfen Natriumhyaluronat und ein Deckglas auf die Hornhaut.
Die transpupilläre Visualisierung des Mausfundus ist nun unter dem chirurgischen Scope verfügbar. Legen Sie den Injektionsort frei, indem Sie die Augenwand mit einer Zahnzange in Richtung der Mitte des Augenblicks schieben. Dann wird die Sklera teilweise mit einer Mikroinjektionsnadel penetriert, die im 90-Grad-Winkel zur Augenwand ausgerichtet ist.
Die oberflächlichen Netzhautgefäße können als anatomische Referenz dienen, um die Nadel im subretinalen Raum zu lokalisieren. Dann injizieren Sie die Netzhauttransplantate. Die vorgeladenen kleinen Bläschen in der Spritze können die Validierung der subretinalen Lokalisation von Spenderzellen erleichtern.
Wenn die Hornhaut trüb wird, halten Sie die Nadel im subretinalen Raum, bis die Hornhaut durchsichtig wird, um den Augeninnendruck zu normalisieren. Fassen Sie den Rand des Injektionslochs und ziehen Sie die Nadel schnell heraus. Das Kriterium für die erfolgreiche Verabreichung der Zellsuspension ist eine konstante Blase im subretinalen Raum.
Eine erfolgreiche Lieferung von Netzhautfolie wird durch eine sichtbare weiße Folie überzeugt. Halten Sie transplantierte Mäuse in einem vorgewärmten, sauberen Erholungskäfig und überwachen Sie sie sorgfältig auf Anzeichen von Not. Wenn dies der Fall ist, geben Sie zwei- bis dreimal einen Tropfen topisches Proparacainhydrochlorid auf das chirurgische Auge.
Bringen Sie die Mäuse zurück in den Hauskäfig, wenn die Mäuse vollständig wach und beweglich sind. Geben Sie eine kleine Anzahl Futterpellets in den Gelbecher auf dem Boden des Käfigs. Wenn die Mäuse Schwierigkeiten haben, den Futtertrichter zu erreichen.
Zwei Monate nach der Transplantation wurde eine multimodale konfokale Scanning-Laser-Ophthalmoskopie durchgeführt, um den Zustand der in vivo beobachteten Netzhauttransplantate zu überprüfen. Die optische Kohärenztomographie im Spektralbereich zeigte, dass die Netzhauttransplantate im subretinalen Raum überlebten und die äußere Kernschicht aller Empfängermäuse rekonstituierten. Die Infrarot-Bildgebung zeigte bei allen transplantierten Mäusen keinen offensichtlichen Katarakt.
Andere chirurgische Komplikationen, einschließlich Blutungen, wurden bei transplantierten Mäusen durch mehrfarbige Reflexionsbildgebung schlecht erkannt. Die histologische Färbung zeigte eine Vielzahl von Zapfen-Photorezeptoren, die OPN1LW:EGFP und S-Opsin in transplantierten Netzhautschichten exprimierten. Ebenso zeigte die Transplantation von Netzhautzellsuspensionen einen großen Anteil an sich erholenden positiven Photorezeptoren in vivo, einschließlich zahlreicher reifer EGFP-positiver Stäbchen.
Die nicht transplantierten Mäuse zeigten eine schwere Degeneration der äußeren Kernschicht mit spärlichen Restzapfen-Photorezeptoren, die eine Erholung ausdrückten. Bei nicht transplantierten Mäusen wurde jedoch kein EGP-Signal nachgewiesen. Diese Studie bietet eine transsklerale chirurgische Plattform mit direkter Führung des transpupillären Sehens für die subretinale Transplantation bei Mausempfängern.
Diese Plattform ermöglicht die präzise Verabreichung bekannter Zelldosen. Es ist relativ einfach, die subretinale Verabreichung zusätzlich zu intraretinalen oder intravitrealen Injektionen für verschiedene Arten von Therapeutika, einschließlich der Gentherapie, zu erlernen und zu erleichtern.
