تجميع عضويات الشبكية مع الخلايا الدبقية الصغيرة

للبدء ، احصل على الخلايا الجذعية الجنينية البشرية في وسط الخلايا الجذعية بكثافة خلية من 80 إلى 90٪بعد إزالة الوسط المستهلك ، اشطف الخلايا في كل بئر بملليلتر واحد من 1X DPBS. احتضان مستعمرات الخلايا الجذعية في كل بئر مع ملليلتر واحد من 0.5 ملليمولار EDTA لمدة خمس دقائق تقريبا عند 37 درجة مئوية. تحقق من مورفولوجيا المستعمرة للتأكد من أن الحواف ملتفة قليلا مع وجود فجوات فضفاضة.

نضح EDTA ، وإذا لزم الأمر ، احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة دقيقة إلى دقيقتين أخريين ، ولكن لا تتجاوز ثماني دقائق. شطف الخلايا برفق في كل بئر مع ستة ملليلتر من المتوسط A تحتوي على ستة ميكرولتر من محلول مثبط ROCK 10 مليمولار Y-27632. اضغط برفق على الجزء السفلي من الطبق للمساعدة في شطف الخلايا.

بعد 24 ساعة ، راقب الخلايا الموجودة تحت المجهر لتأكيد تكوين جسم الجنين. باستخدام ماصة 10 ملليلتر ، اجمع أجسام الأجنة في أنبوب طرد مركزي سعة 15 ملليلتر وانتظر حتى تستقر أجسام الأجنة في القاع لمدة خمس دقائق. ثم استنشاق المادة الطافية بعناية وإعادة تعليق أجسام الجنين في ستة ملليلتر من الوسط الطازج A.نقلها إلى بئر جديد منخفض الالتصاق من صفيحة من ستة آبار وثقافة في حاضنة 37 درجة مئوية.

في اليوم الرابع ، قم بتغطية طبق 10 سم بثلاثة ملليلتر من محلول جيلاتين السمك بنسبة 0.1٪ واحتضانه لمدة ساعة على الأقل في حاضنة 5٪ من ثاني أكسيد الكربون ، 37 درجة مئوية. ثم قم بإزالة محلول الجيلاتين وشطف الطبق مرة واحدة مع خمسة إلى ستة ملليلتر من 1X DPBS. اجمع أجسام الأجنة بعناية في أنبوب طرد مركزي سعة 15 ملليلتر وانتظر حتى تستقر أجسام الأجنة في القاع في غضون خمس دقائق.

أعد تعليق أجسام الجنين برفق ب 15 مل من الوسط B وانقلها إلى الطبق المطلي بطول 10 سم. الثقافة في حاضنة 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة أسبوع واحد بعد 49 يوما. أجهزة الطرد المركزي الخلايا في 200 × غرام لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة.

استنشاق بعناية طاف وإعادة تعليق الخلايا مع ملليلتر من وسط جديد C.نقل إلى بئر جديد منخفض الالتصاق من لوحة ستة آبار. احتضان اللوحة في حاضنة 5 ٪ من ثاني أكسيد الكربون ، 37 درجة مئوية. في اليوم 56 ، استبدل الوسط المستهلك بملليلتر من الوسط C لكل بئر.

افحص اللوحة تحت المجهر لتحديد الخلايا الدبقية الصغيرة المتفرعة تلتصق بقاع بئر الالتصاق المنخفض. لحصاد الخلايا الدبقية الصغيرة للزراعة المشتركة ، استبدل بلطف الوسط C في كل بئر ب Accutase ملليلتر واحد واحتضانه عند 37 درجة مئوية لمدة ثلاث دقائق. باستخدام ماصة خمسة ملليلتر ، اجمع الخلايا الدبقية الصغيرة في أنبوب سعة 15 ملليلتر وطرد مركزي الخلايا عند 200 × جم لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة.

بعد التخلص من المادة الطافية ، قم بتعليق الخلايا الدبقية الصغيرة بمليلتر واحد من الوسط E.