Pour commencer, obtenez les cellules souches embryonnaires humaines dans le milieu de cellules souches avec une densité cellulaire de 80 à 90%Après avoir retiré le milieu épuisé, rincez les cellules de chaque puits avec un millilitre de 1X DPBS. Incuber les colonies de cellules souches dans chaque puits avec un millilitre d’EDTA de 0,5 millimolaire pendant environ cinq minutes à 37 degrés Celsius. Vérifiez la morphologie de la colonie pour confirmer que les bords sont légèrement recourbés avec des espaces lâches.
Aspirez l’EDTA et, si nécessaire, incubez les cellules à 37 degrés Celsius pendant encore une à deux minutes, mais ne dépassant pas huit minutes. Rincez doucement les cellules de chaque puits avec six millilitres de milieu A contenant six microlitres de solution d’inhibiteur de ROCK Y-27632 de 10 millimolaires. Tapotez doucement le fond du plat pour aider à rincer les cellules.
Après 24 heures, observez les cellules au microscope pour confirmer la formation du corps embryonnaire. À l’aide d’une pipette de 10 millilitres, recueillez les corps embryonnaires dans un tube centrifuge de 15 millilitres et attendez que les corps embryonnaires se déposent au fond pendant cinq minutes. Ensuite, aspirez soigneusement le surnageant et remettez en suspension les corps embryonnaires dans six millilitres de milieu frais A. Transférez-les dans un nouveau puits à faible adhérence d’une plaque à six puits et cultivez-les dans un incubateur à 37 degrés Celsius.
Le quatrième jour, enduire un plat de 10 centimètres de trois millilitres de solution de gélatine de poisson à 0,1 % et incuber pendant au moins une heure dans un incubateur à 5 % de dioxyde de carbone et à 37 degrés Celsius. Retirez ensuite la solution de gélatine et rincez le plat une fois avec cinq à six millilitres de 1X DPBS. Recueillez soigneusement les corps embryonnaires dans un tube centrifuge de 15 millilitres et attendez que les corps embryonnaires se déposent au fond en cinq minutes.
Remettez doucement en suspension les corps embryonnaires avec 15 millilitres de milieu B et transférez-les dans la boîte enrobée de 10 centimètres. Cultiver dans un incubateur à 37 degrés Celsius, 5% de dioxyde de carbone pendant une semaine après 49 jours. Centrifugez les cellules à 200 x g pendant cinq minutes à température ambiante.
Aspirez soigneusement le surnageant et remettez les cellules en suspension avec deux millilitres de milieu frais C. Transférez dans un nouveau puits à faible adhérence d’une plaque à six puits. Incuber la plaque dans un incubateur à 5 % de dioxyde de carbone et à 37 degrés Celsius. Le 56e jour, remplacez le milieu épuisé par deux millilitres de C moyen par puits.
Examinez la plaque au microscope pour identifier la microglie ramifiée qui adhère au fond du puits à faible adhérence. Pour récolter la microglie en vue de la co-culture, remplacez doucement le milieu C dans chaque puits par un millilitre d’Accutase et incubez à 37 degrés Celsius pendant trois minutes. À l’aide d’une pipette de cinq millilitres, prélevez les cellules de la microglie dans un tube de 15 millilitres et centrifugez les cellules à 200 x g pendant cinq minutes à température ambiante.
Après avoir jeté le surnageant, suspendez la microglie avec un millilitre de milieu E.
