Для начала получите эмбриональные стволовые клетки человека в среде стволовых клеток с плотностью клеток от 80 до 90%. После удаления отработанной среды промойте клетки в каждой лунке одним миллилитром 1X DPBS. Инкубируйте колонии стволовых клеток в каждой лунке с помощью одного миллилитра 0,5 миллимолярного ЭДТА в течение примерно пяти минут при температуре 37 градусов Цельсия. Проверьте морфологию колонии, чтобы убедиться, что края слегка загнуты вверх со свободными зазорами.
Отсадите ЭДТА, и при необходимости инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия еще одну-две минуты, но не более восьми минут. Аккуратно промойте клетки в каждой лунке шестью миллилитрами среды А, содержащей шесть микролитров 10 миллимолярного раствора ингибитора ROCK Y-27632. Аккуратно постучите по дну посуды, чтобы промыть клетки.
Через 24 часа понаблюдайте за клетками под микроскопом, чтобы подтвердить формирование тела эмбриона. С помощью пипетки объемом 10 миллилитров соберите тела эмбрионов в центробежную пробирку объемом 15 миллилитров и подождите, пока тела эмбрионов осядут на дно в течение пяти минут. Затем осторожно аспирируйте надосадочную жидкость и ресуспендируйте тела эмбриона в шести миллилитрах свежей среды А. Перенесите их в новую лунку с низкой адгезией шестилуночного планшета и закваливайте в инкубаторе при температуре 37 градусов Цельсия.
На четвертый день покройте 10-сантиметровую миску тремя миллилитрами 0,1% раствора рыбьего желатина и инкубируйте не менее одного часа в инкубаторе с 5% углекислым газом и температурой 37 градусов Цельсия. Затем удалите желатиновый раствор и ополосните блюдо один раз пятью-шестью миллилитрами 1X DPBS. Аккуратно соберите тела эмбриона в центробежную пробирку объемом 15 миллилитров и подождите, пока тела эмбриона осядут на дно через пять минут.
Аккуратно суспендируйте тела эмбриона 15 миллилитрами среды В и переложите их в покрытую покрытием 10-сантиметровую посуду. Культивирование в инкубаторе с температурой 37 градусов Цельсия, 5% углекислого газа в течение одной недели через 49 дней. Центрифугируйте ячейки при температуре 200 x g в течение пяти минут при комнатной температуре.
Осторожно отсасывайте надосадочную жидкость и ресуспендируйте клетки двумя миллилитрами свежей среды С. Перенесите в новую лунку с низкой адгезией шестилуночный планшет. Инкубируйте планшет в инкубаторе с 5% углекислым газом, температурой 37 градусов Цельсия. На 56 день замените отработанную среду двумя миллилитрами среднего С на лунку.
Рассмотрите пластину под микроскопом, чтобы выявить разветвленную микроглию, прилипшую к дну колодца с низким сцеплением. Чтобы собрать микроглию для совместного выращивания, аккуратно замените среду C в каждой лунке одним миллилитром Аккутазы и инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия в течение трех минут. С помощью пятимиллилитровой пипетки соберите клетки микроглии в 15-миллилитровую пробирку и центрифугируйте клетки при давлении 200 x g в течение пяти минут при комнатной температуре.
После отбрасывания надосадочной жидкости подсузьте микроглию одним миллилитром среды Е.
