Para começar, obtenha as células-tronco embrionárias humanas no meio de células-tronco com uma densidade celular de 80 a 90%Após remover o meio gasto, enxágue as células em cada poço com um mililitro de 1X DPBS. Incube as colônias de células-tronco em cada poço com um mililitro de EDTA 0,5 milimolar por aproximadamente cinco minutos a 37 graus Celsius. Verifique a morfologia da colônia para confirmar se as bordas estão ligeiramente enroladas com lacunas soltas.
Aspire o EDTA e, se necessário, incube as células a 37 graus Celsius por mais um a dois minutos, mas não excedendo oito minutos. Enxágue suavemente as células em cada poço com seis mililitros de meio A contendo seis microlitros de solução de inibidor de ROCK Y-27632 de 10 milimolares. Bata suavemente no fundo do prato para ajudar a enxaguar as células.
Após 24 horas, observe as células ao microscópio para confirmar a formação do corpo embrionário. Usando uma pipeta de 10 mililitros, colete os corpos embrionários em um tubo centrífugo de 15 mililitros e espere que os corpos embrionários se assentem no fundo por cinco minutos. Em seguida, aspire cuidadosamente o sobrenadante e ressuspenda os corpos embrionários em seis mililitros de meio fresco A. Transfira-os para um novo poço de baixa adesão de uma placa de seis poços e cultive em uma incubadora a 37 graus Celsius.
No quarto dia, cubra um prato de 10 centímetros com três mililitros de solução de gelatina de peixe a 0,1% e incube por pelo menos uma hora em uma incubadora de dióxido de carbono a 5% e 37 graus Celsius. Em seguida, remova a solução de gelatina e enxágue o prato uma vez com cinco a seis mililitros de 1X DPBS. Colete cuidadosamente os corpos embrionários em um tubo centrífugo de 15 mililitros e espere que os corpos embrionários se assentem no fundo em cinco minutos.
Ressuspenda suavemente os corpos embrionários com 15 mililitros de meio B e transfira-os para o prato revestido de 10 centímetros. Cultura em incubadora de 37 graus Celsius, 5% de dióxido de carbono por uma semana após 49 dias. Centrifugar as células a 200 x g durante cinco minutos à temperatura ambiente.
Aspire cuidadosamente o sobrenadante e ressuspenda as células com dois mililitros de meio fresco C. Transfira para um novo poço de baixa adesão de uma placa de seis poços. Incube a placa em uma incubadora de 5% de dióxido de carbono, 37 graus Celsius. No dia 56, substitua o meio gasto por dois mililitros de meio C por poço.
Examine a placa ao microscópio para identificar a microglia ramificada que adere ao fundo do poço de baixa aderência. Para colher micróglia para co-cultura, substitua suavemente o C médio em cada poço por um mililitro de Accutase e incube a 37 graus Celsius por três minutos. Usando uma pipeta de cinco mililitros, colete as células da microglia em um tubo de 15 mililitros e centrifugue as células a 200 x g por cinco minutos em temperatura ambiente.
Depois de descartar o sobrenadante, suspenda a microglia com um mililitro de E médio.
